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单纯疱疹病毒1型(Herpes Simplex Virus, HSV-1)在人群中的感染较为普遍,它通常会以潜伏态存在于人体神经细胞中,其反复发作给人类造成很大的痛苦。HSV侵入人体后还有助于其他病毒的共感染,例如HIV。HSV-1是有包膜的线状双链DNA病毒,其基因组约为150kb,其中的γ134.5基因编码重要的神经毒性因子ICP34.5,对病毒的复制和致病性起关键作用。
宿主细胞被病毒或病原体感染后会激活一系列的固有免疫反应(innateimmunity),包括诱导干扰素的产生以及其他重要抗病毒蛋白的生成,重要的效0应之一是活化依赖双链RNA的蛋白激酶PKR,从而使真核细胞翻译起始因子eIF2α磷酸化,导致宿主细胞蛋白合成的终止,起到抑制病毒复制的效果。HSV-1的ICP34.5通过与宿主的蛋白磷酸酶1(PP1)结合,介导eIF2α的去磷酸化,使蛋白合成继续进行,因而间接地逆转PKR的作用和宿主抗病毒功能。HSV-1(F-strain)的ICP34.5由263个氨基酸组成,在结构上分为三个部分,即带有160个氨基酸残基的N端,功能上与病毒释放有关；中间由10个三联氨基酸(Ala-Thr-Pro)重复构成的连接区,重复数在不同的毒株中有所不同,影响病毒的神经侵袭能力；羧基末端是由73个氨基酸残基构成,含有PP1结合基序和效应区,负责结合PP1并介导eIF2α的脱磷酸化。重组病毒研究表明,ICP34.5羧基端在病毒抵御宿主细胞免疫反应(如干扰素作用)中发挥重要功能,但具体的作用机制还有待解析。
本论文研究聚焦于揭示ICP34.5在抗干扰素作用中的分子细节。通过与HSV-1和HSV-2等序列比对发现,羧基末端区域有一个富含Arg的高度保守基序,并与人的GADD34以及鼠的MyD116具有高度相似性,缺失突变结果提示该基序可能对蛋白的合成调节起重要的作用。蛋白二级结构预测发现,这个富含Arg的基序恰好位于羧基端第三个α螺旋之中；本文建立了分析ICP34.5的方法,并利用点突变对这一保守区域的分子机制在分子和细胞水平进行了研究,发现将Arg249,251和255突变为酸性氨基酸明显影蛹ICP34.5的活性,即无法介导PP1对磷酸化的eIF2α进行脱磷酸化反应；利用γ134.5缺失的病毒株(R3616)对携带有ICP34.5野生型及突变型基因的NIH3T3细胞进行感染,通过病毒蛋白合成以及细胞病变情况进一步印证了ICP34.5这几种突变体的感染细胞中,细胞的内源eIF2α磷酸化程度明显增高,蛋白合成能力下降,因病毒复制能力下降而造成细胞病变效应(CPE)变得非常不显著；另外,通过体外免疫共沉淀实验和细胞内的双分子荧光互补实验(BIFC),在活细胞中观察到了脱磷酸化复合物的分布,证明了ICP34.5的Arg突变不影响或微弱地影响其与PP1的结合；我们还首次观察到ICP34.5和eIF2a的结合及共定位,为ICP34.5的抗干扰素作用提供了新的分子机制。本论文对ICP34.5介导PP1的活性以及抗宿主反应的分子机制做了详尽的研究,并在ICP34.5结构(羧基端效应区)和功能的关系上提出了新的假设和作用模型。确定ICP34.5的结构和功能的关系对于了解HSV的致病机制和潜伏机制、发挥HSV及其突变的临床应用性具有重要意义。