前言 新生儿肺出血(PHN)是NICU中常见的危重症，病死率高达40％～50％。本病发病机制不清，以往人们曾提出感染—免疫复合物损害、左心衰竭导致出血性肺水肿、出凝血机制障碍和高血粘滞度等学说，但都不能全面地解释本病的发病机制。近年来，许多学者研究证实，肺出血的发生机制为肺毛细血管张力衰竭，表现为肺毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞结构破坏，并证实张力衰竭的根本原因为肺动脉及肺毛细血管压力增加。韩玉昆等在研究新生儿休克过程中发现绝大多数休克患儿死于呼吸衰竭和肺出血，胸部X线片有弥漫性侵润改变，病理切片上除出血外，还可看到部分肺泡壁上有透明膜形成，电镜下可见肺泡毛细血管内皮细胞、Ⅱ型肺泡上皮细胞的损伤，少数白细胞粘附于毛细血管壁上；李娟等在PHN的临床研究中发现肺出血新生儿的肺动脉压力明显增高。这些现象表明，PHN的胸部X线表现、病理和血液动力学改变与急性呼吸窘迫综合征(ARDS)非常相似，即均表现为肺泡—毛细血管膜的损伤和肺动脉高压。因此，我们推测PHN很可能与ARDS一样，是一些疾病危重阶段各种病理因素导致肺损伤的一种病症，是ARDS在新生儿期的一种特殊表现，PHN的发病机制可能与ARDS密切相关。 ARDS是各种原因引起的肺部失控性炎症反应的结果，是急性肺损伤(ALI)发展的严重阶段。目前对其认识和发病机制的研究已不断深入，认为炎症反应的始动阶段为一复杂的炎症细胞和组织细胞交互作用过程，起始机制为转录因子核因子-κB(NF-κB)活化，调节多种促炎症介质(如TNF-α、IL-1β等)、细胞间粘附分子(如ICAM-1等)的基因表达，促使中性粒细胞(PMN)在肺内聚集、粘附和激活释出大量活性氧、溶组织白酶和炎症介质，作为局部免疫反应过程，但反应过度可导致肺泡—毛博士研究生论文细血管膜的损伤、肺表面活性物质(PS)的减少和功能障碍，临床上表现为ALI/ARDS。弥漫性肺泡一毛细血管膜损伤是ALllARDS特征性的病理改变。肺组织中40%为内皮细胞，内皮细胞损伤可导致出血、血管内凝血和血管张力调节紊乱，促进ALI/ARDS时肺动脉高压的形成。可见，ALI/ARDS时存在着肺出血的病理生理基础。但有关PHN与ALI/ARDS的关系国内外尚无报道。 严重感染、败血症是PHN的主要诱因，革兰氏阴性菌产物脂多糖 (LPS)是制备成年动物ALI模型中最常使用的处理因素。因此，为证实我们的假设，探讨PHN的发病机制，明确PHN与ALI/A RDS的关系，本研究从动物实验的角度出发，利用LPS制备新生和成年Wistar大鼠动物模型，然后从形态学、生物化学和分子生物学等方面观察LPS对新生大鼠肺组织的影响，回答LPS是否能引起新生大鼠肺损伤、肺出血及其机制的问题;同时与成年大鼠进行比较，研究新生大鼠急性肺损伤的病理特点及其与肺出血的关系，为PHN的临床早期诊断和治疗提供依据。材料与方法 一、动物模型 于实验前4h将新生大鼠与母鼠分开禁食，成年大鼠亦禁食4h:将新生大鼠和成年大鼠各随机分成2组:LPS实验组和生理盐水(NS)对照组。LPS实验组:LPS按不同剂量腹腔注射，即制成动物模型;NS对照组:用等量NS腹腔注射。致伤后大鼠自由活动。 1一组新生大鼠LPs分别按0.5、1、2、3和4 mg/kg注射和相应的NS对照组(每组3只)于给药后lh处死。 2.另一组LPS按smg/kg注射，分别于给LPS后不同时间(30min、lh、Zh、4h、sh、16h和24h)处死，每个时间点6只:成年大鼠LPS组以同样方法给药，于相同时间点处死，每个时间点各6只。 二、标本采集和处理 LPS及对照组，于各时间点用5%戊巴比妥钠2009/kg(0.201/1009体重)腹腔麻醉，打开胸腹腔，取肺组织，按以下方式分别保存: 1.标本置于含4%的多聚甲醛中固定;博士研究生论文.浸入2.5%戊二醛中固定;.置于液氮及一80℃冰箱中冻存: 4.无菌条件下取材，置于无RNase的Eppendorf管中于液氮及一80℃冰箱中冻存。 三、实验方法 1.肺出血和AIJI指标观察 (l)大体检查LPS及对照组，于各时间点腹腔麻醉后，打开胸腹腔，观察肺、心、肝、肾脏组织改变，注意是否有出血改变，尤其是肺脏。 (2)光镜检查固定后的组织常规脱水，包蜡，切片，行HE染色，光镜下观察。 (3)超微结构观察固定后的组织经漂洗、后固定、酒精梯度脱水，Epon812浸透包埋，超薄切片，醋酸铀和柠檬酸铅复染，于透射电镜下观察。 (4)肺湿重/干重(W/D)比值测定取右上肺叶称湿重(W)后，置70℃恒温箱，24小时后再称干重(D)，计算W/D比值。 (5)支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞分类腹腔麻醉后，暴露气管，行气管切开，套管针插入气管，用生理盐水反复灌洗，收集灌洗液:离心灌洗液，取沉渣，涂片，瑞氏染色，计数200个细胞进行分类。 (6)髓过氧化物酶(MPO)活性测定采用化学方法测定肺组织协P()活性。 2.肺组织TNF一。、ICAMq及1 KB。表达的检测 (1)肺组织TNF一Q蛋白水平的测定采用酶联免疫分析方法(ELISA法)测定肺组织‘rNF一Q含量。 (2)肺TNF一Q mRNA表达的检测采用反转?