目的:探究利用全飞秒激光小切口微透镜摘除术（small incision lenticule extraction,Smile）来源的角膜基质透镜体外分离、培养角膜基质层成纤维细胞的方法;研究纤维蛋白粘合剂对角膜基质层成纤维细胞的毒性作用;利用纤维蛋白粘合剂粘贴双层角膜基质透镜,构建组织工程角膜基质支架;评估双层角膜基质透镜支架的最佳保存方式;探讨角膜缘干细胞和骨髓间充质干细胞可否作为组织工程角膜的上皮细胞来源。方法:（1）酶消化法将Smile术来源的角膜基质透镜在体外分离、培养出角膜基质层成纤维细胞;（2）将纤维蛋白粘合剂与角膜基质层成纤维细胞复合培养48h,观察细胞在纤维蛋白粘合剂表面的的生长状态;（3）将不同浓度的纤维蛋白粘合剂浸提液与角膜基质层成纤维细胞共培养,通过AO/EB法观察细胞凋亡、MTT法检测细胞的生存率及流式细胞术检测细胞的生长及凋亡状态,探究纤维蛋白粘合剂对角膜基质层成纤维细胞生长状态的影响;（4）用纤维蛋白粘合剂粘贴双层角膜基质透镜,并分别保存于甘油、透明质酸钠、模拟湿房环境或胎牛血清中,并置于4℃环境保存14d,观察角膜基质支架的稳定性;（5）将双层角膜基质透镜置于无水甘油中脱水,分别保存于常温、4℃及-20℃环境中14天,比较三组支架其硬度、透明度及稳定性。（6）将1mm左右的人角膜缘组织剪碎后,用0.25%含EDTA的胰蛋白酶消化5min,收集脱落下的细胞沉淀,将细胞与未消化的组织一同置入完全培养基,直接贴附于细胞培养板底,加入少量完全培养基,于37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养,使角膜上皮细胞逸出;（7）收集大鼠股骨骨髓,置于密度梯度分离液上层,以2000r/min离心30min,去除上清。用无菌PBS清洗细胞沉淀2～3次,以1×10~8浓度接种至细胞培养瓶,获得大鼠骨髓间充质干细胞。以此作为利用人骨髓在体外培养骨髓间充质干细胞的实验基础,为下一步将人骨髓间充质干细胞诱导分化为角膜上皮细胞,并与人角膜缘干细胞来源的角膜上皮细胞作比较奠定实验基础。结果:（1）Smile来源的角膜基质透镜可在体外培养出角膜基质层成纤维细胞。与纤维蛋白粘合剂共培养48h后,角膜基质层成纤维细胞附着于纤维蛋白粘合剂表面生长,细胞呈现正常的长梭形、排列整齐、增殖能力良好;（2）角膜基质层成纤维细胞在纤维蛋白粘合剂浸提液及完全培养基中分别培养48h后,使用AO/EB染色法检测,荧光显微镜下见浸提液组、完全培养基组大量核染色质着绿色的活细胞,仅有极少量着黄绿色的凋亡细胞;（3）MTT检测结果显示,0～72h内实验组和对照组细胞具有相似的增殖趋势。实验组36～48h细胞毒性评级为0级,24h内及60～72h细胞毒性评级为1级,0～72h细胞相对增殖率均超过90%;（4）流式细胞术检测细胞凋亡实验结果显示,正常对照组、1×浸提液与2×浸提液组的细胞凋亡率分别为4.96%±1.09%、3.66%±1.35%、2.88%±0.66%,三组细胞的凋亡率差异无统计学意义（P＞0.05）;（5）使用纤维蛋白粘合剂粘贴的双层角膜基质透镜透明度良好,无水甘油及湿房保存的支架稳定性最高,优于透明质酸钠组,胎牛血清组稳定性最低;（6）双层角膜基质透镜支架在不同温度无水甘油保存实验中,-20℃组保存效果最佳,优于4℃组及常温组（P＜0.05）;（7）组织块培养法联合酶消化法处理后的角膜缘组织种瓶后,2～3d可见多边形扁平状上皮细胞从组织块边缘爬出并逐渐形成“沙滩样”匍行带,约3～5天可见细胞晕,约5～7d细胞融合成片;（8）用密度梯度离心法处理大鼠骨髓,将获得的骨髓间充质干细胞种瓶后,约72h细胞逐渐由圆形舒展为梭形。约5～7d细胞体积增大,部分细胞出现核分裂现象。约7d后细胞生长速度加快,核分裂现象明显,细胞排列紧密。约14d后细胞融合成片,呈旋涡状生长。结论:（1）Smile来源的角膜基质透镜可在体外分离培养出角膜基质层成纤维细胞;（2）纤维蛋白粘合剂与角膜基质层成纤维细胞具有良好的生物相容性,对角膜基质层成纤维细胞无毒性作用;（3）纤维蛋白粘合剂可用于粘贴多层角膜基质透镜构建组织工程角膜基质支架;（4）-20℃无水甘油是角膜基质透镜支架的较佳保存条件;（5）角膜缘干细胞和骨髓间充质干细胞均可在体外分离、培养。角膜缘干细胞的培养周期短,操作步骤简单,且体外培养后可直接获得角膜上皮细胞。但在角膜缘干细胞难以取得的情况下,骨髓间充质干细胞可作为角膜缘干细胞的“替代”,用于获取角膜上皮细胞。