肌强直综合征(Myotonic myopathies，MM)是一组原发/继发离子通道蛋白（CL-/Na+/Ca2+/K+）结构/功能异常、骨骼肌细胞膜去极化紊乱、持续重复放电的遗传性骨骼肌疾病，临床表现为:肌肉僵直/肌强直、肌肉萎缩朋巴大、肌无力;电生理呈典型肌强直电位，伴/不伴肌病电位。根据临床症状分为萎缩性肌强直(Dystrophic myotonia，DM)及非萎缩性肌强直(Non-dystrophic myotonias, NDMs)。　　本研究基于骨骼肌遗传资源标本库(2004.9-2014.12)，从1356例骨骼肌疾病筛选强直性肌营养不良（25例，含6例家系）、非萎缩性肌强直（17例，含5例家系），进行肌强直综合征的临床及分子生物学研究，旨在建立DMs及NDMs分子生物学诊断平台，报告中国人群肌强直综合征基因变异特点，回顾性分析临床及骨骼肌病理特点，丰富肌强直综合征的临床表型及遗传表型，尝试钠通道阻滞剂（卡马西平/美西律）治疗肌强直综合征，减轻临床症状，为产前诊断提供分子生物学依据。　　第一部分 优化PCR应用于强直性肌营养不良分子生物学诊断　　目的:DMs由DMPK(DM1)/Znf9(DM2)非编码区(CTG)n/(CCTG)n核苷酸重复序列异常扩增致病。　　DMs高度临床/遗传异质性以及基因变异特点，使PCR方法检测核苷酸重复序列数成为其最终诊断的可靠方法。大片段核苷酸序列的扩增及模板高GC含量对扩增效率的影响显著限制PCR诊断效率，建立符合DM基因变异特点的分子生物诊断方法是临床的迫切需求，优化传统PCR引物序列，变性、退火及延长等反应程序检测核苷酸重复序列数目，是本研究的技术关键。　　方法:　　1.在遗传性骨骼肌疾病资料标本库中标本筛选42例肌强直综合征患者（11例家系）作为优化PCR检测对象。　　2.基因分析　　①签署知情同意书，抽取2ml外周静脉血提取基因组DNA。以Primer5.0软件进行PCR反应引物序列设计，覆盖DMPK，ZNF9基因全长。　　②传统PCR反应参数优化，包括变性、退火、延伸阶段时间、温度。　　③对上述入选病例及家系成员进行DMPK及Znf9扩增，2.5％琼脂糖凝胶电泳进行产物分离纯化，DHPLC进行DMs杂合/纯合样品检测验证　　④ABI377自动测序仪进行测序分析，将测序结果以Sequencher4.90软件正常人类基因组参照序列进行比对分析。　　结果:　　1.最终引物序列:　　DMPK(450bp):　　Forward primer:5-CGA CTC CGG GGC CCC GTT GGA AGA CT-3;　　Reverse primer:5-CTC CCC AGA GCA GGG CGT CAT GCA CAAG-3;　　ZNF9(295bp):　　Forward primer:5-GGC CTT ATA ACC ATG CAA AT-3;　　Reverse primer:5-GCC TAG GGG ACA AA GTGAGA-3;　　2.优化传统PCR反应程序:　　①优化DMPK循环参数。　　②优化Znf9循环参数。　　③循环体系最终确立，反应体系中不添加任何辅助添加剂。　　④DHPLC纯合/杂合检测。　　3.基因诊断分型:　　应用优化PCR对42例入选样本进行基因诊断分型，22例DMPK纯和样本;20例DMPK杂合样本。2.5％琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物。正常对照PCR扩增产物450bp，(CTG)n重复数约为20。22例患者(CTG)n重复数53-683，平均CTG）n重复序列数约535。对17例先证者家系成员进行(CTG)n重复数检测，证实5例女性患者的儿子(CTG)n异常扩增，平均(CTG)n重复数约520次。1例男性患者母亲及小姨(CTG)n重复序列数分别为103、180次。优化传统PCR对3例杂合样本及4例无关对照个体进行Znf9扩增，2.5％琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物。正常对照PCR扩增产物295bp，(CCTG)n重复数约为20次。结果示3例患者(CCTG)n重复序列数400-450次，平均(CCTG)n重复序列数约416次。17例样本DMPK及Znf9阴性。　　结论:　　1.高GC含量样本在PCR反应引物序列设计时，设定较高退火温度(Tm)可有效降低ΔG反应能，提高PCR扩增反应效率。　　2.高GC含量样本的PCR反应程序设定，缩短退火时间、提高退火温度、增加延伸反应时间及升高延伸温度能有效提高扩增效率。　　3.本研究优化PCR反应，建立了高效、经济及简便DM分子生物学诊断方法，可应用DM的分子生物学诊断及鉴别诊断，推荐广泛临床应用。　　第二部分 强直性肌营养不良临床及骨骼肌病理研究　　目的:本研究回顾性分析25例临床、病理及优化PCR基因检测诊断为DMs患者临床资料，总结、分析中国DMs临床表型及骨骼肌病理特点。　　方法:　　1.临床病例资料收集　　回顾性总结分析25例第一部分研究明确诊断证实为DMs患者临床病例资料。　　2.骨骼肌病理分析　　全部患者签署病理诊断及分子生物学诊断知情同意书。肱二头肌开放式骨骼肌活检获取标本(1×0.5 cm)，迅速异戊烷/液氮冷冻，13种常规组织化学、酶学染色（苏木精-伊红、改良Gomori三原色、还原型辅酶Ⅰ-四氮唑还原酶、琥珀酸脱氢酶、单磷酸腺苷脱氨酶、细胞色素C氧化酶、三磷酸腺苷环化酶、酸性磷酸酶、过碘酸雪夫氏、油红O/苏丹黑B）。　　结果:　　1.22例确诊DMs基本临床表现:电生理肌强直电位/伴少量肌病电位，美西律、卡马西平联合治疗肌强直症状显著改善。22例DM1，9例男性，13例女性，四肢远端肌起病肌无力、肌萎缩（动作笨拙缓慢僵硬），叩击性肌球(+)，17/22 DM1不同程度伴心脏病（束支传导阻滞为主）、白内障(7)、甲状腺(1)、内分泌(1)、中枢神经系统受累(6);3例DM2四肢近端肌无力起病，肌球(+)，临床症状轻，3例伴不同程度心脏功能异常，余系统受累（-）。　　2.骨骼肌病理:肌源性改变，散在肌纤维变性、坏死、再生，结缔组织轻至中度增生;可见中心核、核内移、肌浆块、核聚集;部分肌纤维酶活性局灶降低，可见虫噬样肌纤维、环状肌纤维。DM1小角化散在;DM1Ⅱ型肌纤维优势、群化，DM2Ⅰ型肌纤维优势。　　结论:　　1.中国人群DMs中DM1发病率显著高于DM2，临床表现典型肌强直伴肌无力、肌肉萎缩，伴多系统受累“综合临床表型”，与既往DMs临床表型报道无显著差异。　　2.DMs骨骼肌病理分析出现上述典型病理表现可提示诊断DMs，DM1Ⅱ型肌纤维优势、群化，DM2Ⅰ型肌纤维优势。　　3.DM1临床及骨骼肌受累程度与(CTG)n呈正相关，核苷酸重复序列数目越多，临床表型越重，起病越早;DM2与发病年龄及病程呈正相关。　　第三部分 非萎缩性肌强直临床及分子生物学研究　　目的:本研究对入选17例NDMs（包括5例先证者家系成员）进行临床、骨骼肌病理分析研究，并应用分子生物学方法明确诊断分型，初步探讨该组疾病在中国人群发病及基因变异特点。　　方法:　　1.病例筛选　　选取第一部分研究中17例DMs筛查阴性患者列入组研究。　　2.活检骨骼肌病理分析，同第一部分。　　3.基因检测　　应用Primer5软件进行PCR反应引物设计，覆盖CLCN-1、SCN4A、KCNE3、CACNA1S基因全长，包括23个外显子、24个外显子、3个外显子、44个外显子及内含子交界区。进行相关致病基因变异位点检测。　　结果:　　1.研究基因分析CLCN-1检测阳性率47％(8/17)，新发7个致病基因位点集中分布在8、12号外显子区域;SCN4A检测阳性率29％(4/17)，新发3个致病位点集中分布在22、24号外显子区域。根据基因分型临床诊断:8例先证者明确诊断MC（1例DMC）;4例先证者明确诊断PC;MC发病人群显著高于PC。　　2.NDMs多5-10岁起病，临床以肌强直为主症，电生理呈肌强直电位，极少伴肌病电位，患者有继发跟腱挛缩、脊柱侧弯现象，部分伴心功能异常。给予卡马西平及美西律联合治疗肌强直症状可得到显著缓解。　　317例NDMs活检骨骼肌肌源性改变，未发现特异性病理结构改变，部分重症患者可见肌细胞变性、坏死、再生，酶活性局灶降低，散在小角化肌纤维（Ⅰ型为主）。9例MC出现ⅡB肌纤维缺如，该特点可用于MC及PMC鉴别诊断。与DMs相区别:NDMs无特异性结构改变及活跃肌纤维变性、坏死、结缔组织重度增生等强直性肌营养不良病理改变，提示活检骨骼肌病理分析有助于强直性肌营养不良与非萎缩性肌强直鉴别诊断，但并能作为该组疾病诊断的金标准。　　结论:　　1.基因检测分析是NDMs诊断及分型诊断的金标准;NDMs涉及致病基因多，二代测序技术的推广能更好用于该组疾病的诊断与分型诊断。　　2.中国人群存在新发CLCN-1/SCN4A致病突变位点，上述致病位点目前尚无数据库报道，扩大了上述基因致病谱。