粘细菌内源性质粒pMF1稳定存在机制的研究

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粘细菌是具有协作能力和滑行运动能力的一类革兰氏阴性细菌,因而是研究细胞群体协作和通讯以及运动的重要模式生物;同时粘细菌还能够产生多种多样的次级代谢产物,具有很高的经济价值。到目前为止,来自Myxococcus fulvus124B02的pMF1质粒是粘细菌中的唯一一个自主复制质粒。本实验室构建的大肠杆菌-粘细菌穿梭质粒pZJY41为我们在粘细菌的遗传操作提供了一个新的、高效的方法。但是在没有选择压力的条件下,质粒pZJY41在粘细菌中极易丢失。后来发现pMF1上的pMF1.21-pMF1.23操纵子能够提高穿梭质粒的遗传稳定性,实验证明该操纵子是pMF1的主动分配系统。然而,与典型的主动分配系统相比,pMF1的par系统多了一个功能未知的基因——pMF1.21(后命名为parC)。  前期实验表明,parC基因对质粒的稳定遗传起到了至关重要的作用。对该基因进行研究发现其能够以蛋白的形式发挥作用,同时实验表明ParC蛋白不能与DNA或ParB结合。那么ParC会不会与ParA有相互作用呢?本论文的第二部分对parC基因进行进一步的研究。对ParA和ParC蛋白的结构进行模建发现ParA表面带正电,ParC表明带负电。蛋白蛋白相互作用预测显示ParA能够形成同源二聚体,ParC蛋白与ParA蛋白间可以预测到两种不同的结合模式,结合能分别为-37.56kJ/mol和-31.15kJ/mol。同时,pull-down实验表明ParA和ParC蛋白确实存在着相互作用。因此,借助ParC蛋白的中介,可以实现两个ParA同源二聚体的聚合,形成ParA-ParA-ParC-ParA-ParA排列的五聚体。这样通过ParA同源二聚体和ParC蛋白的交替结合,可以产生细长的纤维丝结构来介导pMF1质粒的分配。  此外,实验室之前的质粒稳定实验表明,带有par系统的pZJY4111质粒虽然稳定性较pZJY41有所提高,但在没有选择压力的条件下,培养168小时后,质粒丢失近一半。据此我们猜测pMF1可能还有其它的基因在影响质粒的遗传稳定性。论文的第三部分探讨发现的一个有助于维持质粒稳定性的后自杀系统。这个后自杀系统由质粒上共转录的基因对pMF1.19-pMF1.20编码。随后对该操纵子进行分析发现,pMF1.20蛋白可以降解核酸,是一种尚未被研究过的核酸酶,pMF1.20通过其核酸酶活性对细胞产生毒性作用,而pMF1.19则编码其对应的免疫蛋白,与pMF1.20具有蛋白蛋白相互作用,pMF1.19蛋白的存在则可以抑制pMF1.20的核酸酶酶活。结合我们之前对pMF1质粒中复制和分配系统的研究,可以确定多种质粒维持机制共同帮助这个低拷贝质粒提高稳定性。
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