以CRISPR/Cas9为代表的第三代基因组编辑技术已经被广泛用于基础研究、品种改良和生物医疗等领域。CRISPR/Cas9技术包含两个不可或缺的元件-Cas9核酸酶和单链导向RNA（Single Guide RNA,sgRNA）,两种元件发挥作用的形式包括体外转录的Cas9 mRNA和sgRNA复合体、Cas9蛋白和sgRNA复合体及包含编码Cas9蛋白和sgRNA的载体。前两种递送形式的安全性高,但是因为体外转录或蛋白纯化过程较为复杂,不利于普遍推广使用。普通载体虽然方便科研工作者使用,但是其基因编辑效率不稳定且具有整合入细胞基因组后不方便被检测到的风险。因此,亟待开发一套高效稳定且可实现无载体残留的新型CRISPR/Cas9打靶系统。针对以上问题,本研究分别采用piggyBac转座子系统和episome游离体系统两种载体形式,希望可以打破普通载体对于基因编辑技术的束缚,更好地推广CRISPR/Cas9技术的应用。本研究构建了基于piggyBac且响应DOX调控的人源化Cas9（hCas9）表达载体系统（PB-iCas9系统）。首先,本研究选取体外培养的小鼠胚胎干细胞（Mouse Embryonic Stem Cells,mESCs）检测并最终证实了 PB-iCas9系统对Cdkn2a、Pten和Trp53三个肿瘤抑制基因（Tumor Suppressor Genes,TSGs）的单基因编辑能力。然后,本研究选取3-4周龄CD1小鼠,通过尾静脉注射PB-NRAG12V IRESEGFP过表达载体和同时敲除Cdkn2a、Pten和Trp53的PB-iCas9混合载体,并在饮水中添加DOX诱导hCas9表达,最终证实PB-iCas9系统能在活体小鼠肝脏中同时敲除多个TSGs,诱导肝脏肿瘤的发生,为构建活体肝脏肿瘤模型提供了工具,这些结果证实了 PB-iCas9系统具有良好的基因编辑能力。最后本研究通过反向PCR寻找PB-iCas9整合入小鼠基因组的位置,并通过qPCR法确定其严格响应DOX调控,瞬时表达PB酶后实现PB转座子的无缝去除,并证实经PB-iCas9系统整合/切除的mESCs核型正常、多能性基因Nanog和Oct4表达正常,表明PB-iCas9系统可用于分离无外源打靶载体残留的mESCs。本研究还构建了基于oriP/EBNA1元件的episome载体系统（oe-Cas9系统）。首先,本研究将重编程因子及表达红色荧光蛋白tdTomato的载体元件递送入小鼠成纤维细胞,并鉴定出整合单拷贝tdTomato的小鼠诱导性多能干细胞（Mouse Induced Pluripotent Stem Cells,miPSCs）,以 oe-Cas9系统转染针对tdTomato的sgRNA之后,检验并证实oe-Cas9系统可以实现对外源整合荧光报告基因的单基因修饰。然后,本研究用HeLa细胞证实了 oe-Cas9系统具备双sgRNA介导的基因组片段删除和位于不同染色体上的三基因同时修饰的能力。在确定了 oe-Cas9系统的基因编辑能力之后,本研究还检测了单克隆细胞系的外源载体去除情况,结果表明无论是DNA水平还是蛋白表达水平,利用oe-Cas9系统均可以成功获得无外源打靶载体残留的基因修饰细胞系。以上实验结果表明,PB-iCas9系统和oe-Cas9系统均可以实现对靶细胞的高效基因组编辑,并最终获得无外源打靶载体残留的细胞系。鉴于载体递送系统的简便性,PB-iCas9系统和oe-Cas9系统将扩展现有的CRISPR/Cas9递送系统,为肿瘤模型的构建、转基因细胞或模式动物的制备提供新的思路。