研究背景及目的人类探索生命奥秘的脚步一直都没有停止,自胡克发现细胞后,人们开始从微观方向开始研究生命,而DNA的发现是探索生命的里程碑,有人预测,如果将人类的基因组全部测出,我们就能了解生命,解释生命。人类基因组计划(human genome project, HGP)是由美国科学家于1985年率先提出,于1990年正式启动的,由美国、英国、法国、德国、日本和我国科学家共同参与了这一预算达30亿美元的人类基因组计划。截止到2005年,人类基因组计划的测序工作已经完成。人类基因组计划旨在通过研究人类的基因来了解人类自身,包括各种生理病理的机制等。虽然人类的基因组已经测序完成,但是没有达到更深一层的目的。人类开始进一步探索生命的执行者——蛋白质。国际人类蛋白质组计划(HPP)是继国际人类基因组计划之后的又一项大规模的国际性科技工程。我国承担了围绕人类肝脏蛋白质组的表达谱、修饰谱及其相互作用的连锁图等九大科研任务。目前,探索蛋白质相互作用的方法主要包括酵母双杂交,噬菌体展示,免疫共沉淀,Pull-down等。这些方法都是目前认为的鉴定蛋白质相互作用的标准技术,但是这些方法程序繁琐,花费时间多,且影响因素较多。本实验希望能够发现检测蛋白质的相互作用的新方法,具有快速,准确的检测。快速准确的检测方法有很多,而标记免疫学是目前运用最多,最广也是探索较多的方法学。标记免疫技术具有快速检测、特异性高、高通量检测等优势。在医院各种疾病的检测多用标记免疫学方法,比如癌症蛋白AFP、CEA的检测,乙肝表面抗原及抗体的检测,血液中蛋白含量的检测等。标记免疫技术也用于基础医学,比如表达蛋白的检测、单克隆抗体的检测等。最常见的标记免疫技术是酶联免疫分析(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、化学发光免疫分析(Chemiluminescence immunoassay, CLIA)、电化学发光免疫分析(Electrochemiluminescent immunoassay, ECLIA)和时间分辨荧光免疫分析(Time-resolved fluoroimmunoassay, TRFIA)。标记免疫技术也各有其优缺点,ELISA中,标记的辣根过氧化物酶比较容易失活,还有可能受抗原抗体空间位阻的影响导致其灵敏度受到限制；CLIA方法缺点就是影响因素过多,例如CLIA方法容易受到外界环境的干扰使其只能用于非开放性检测,使用原料多为进口价格昂贵,最重要的是样品无法重复测量；TRFIA、ECLIA方法是CLIA方法的改进,但是原料依然较高且为封闭性检测；以上技术程序繁琐且需要洗涤。因此,许多运用新理论新技术的标记免疫技术应运而上。其中,光激化学发光免疫分析(Amplified luminescent proximity homogenous assay, AlphaLISA)技术就是其一,也是本实验主要的检测技术。AlphaLISA工作原理是运用抗原抗体的特异性结合及光激化学发光技术。使用这种检测方法用于检测蛋白质相互作用的优势是使用的样品量比之传统方法要少,检测的时间较短,并且能够进行大量样品的检测。胰岛素样生长因子受体1(Insμ Lin like growth factor type 1,IGF-1R)全长1366个氨基酸,其三维结构是由两条IGF1R蛋白,每个蛋白在蛋白酶的作用下分成α和β段,最终形成一个四聚体结构。IGF1R参与了多个生理反应：外分泌胰腺发育；乳腺发育；男性的性别决定；免疫应答；大脑发育；胰岛素受体信号转导通路；细胞增殖正调控；有丝分裂的正调控；转录因子活性的负调控；细胞凋亡等；参与多个信号通路：AKT Pathway, Ins μ Lin Pathway, ApoptosisPathway, NF-kappa B Pathway, mTOR Pathway等。在肿瘤中,IGF1R也起到重要作用,可能参与到肿瘤的生长、侵袭、抗凋亡和转移等。IGF1R蛋白可以与多种蛋白如Csk、SOCSKGRB10、FAK等有直接相互作用参与信号通路。有关报道,IGF1R与Csk、SOCS1存在相互作用。C-Src蛋白酪氨酸激酶(C-Src tyrosine kinase, Csk)是Src激酶家族(SFKs)的成员,为SFKs的负调节蛋白。Csk是非受体酪氨酸激酶,需要跨膜受体如IGF1受体,EGF受体,T细胞受体或跨膜衔接蛋白如CBP等的帮助完成信号传递。推测Csk发挥功能与其同这些蛋白的相互作用有关。SOCS1是细胞因子信号(SOCS)蛋白家族抑制器的一个成员,SOCS1成为肿瘤的研究热点。在某些肿瘤,SOCS1表达,SOCS1基因甲基化,突变和缺失下降。SOCS1已经在许多癌症中,例如结肠直肠癌,乳腺癌,肝癌发挥了重要的作用。IGF1R与多种不同蛋白的相互作用使其发挥不同的功能,因此研究不同生理病理过程中IGFR的蛋白相互作用非常重要。我们希望通过一种新的方法来研究蛋白质与蛋白质的相互作用。方法：采用双抗体夹心法研制IGF1R与蛋白Csk、SOCS1等的光激化学发光免疫分析法。1.制备IGF1R抗体的原料制备：提取Hela细胞的RNA,使用逆转录试剂盒得到cDNA。使用Primer 5软件、pMal-c2x载体图谱及GenBank中IGF1R基因序列(NM 001291858)设计IGF1R蛋白的β段引物,在下游引物上加入6个his标签,并在引物两端加入BamH I、 EcoR I酶切位点及保护碱基。通过PCR得到目的基因。将pMal-c2x载体同获得的PCR产物同时进行BamH I、EcoR I双酶切,酶切产物连接后转入到TOP10感受态中。使用酶切和测序鉴定重组质粒是否成功。将鉴定重组成功的质粒转入到BL21感受态中,通过改变诱导的温度及诱导剂IPTG浓度获得最佳表达条件。按照最佳表达条件进行大量表达。收集诱导后的细菌重悬、反复冻融、超声破碎、高速低温离心等,得到表达上清,通过SDS-PAGE考马斯亮蓝染色进行表达鉴定。将上清分别经过AmyloseResin和镍柱进行亲和层析纯化,通过SDS-PAGE考马斯亮蓝染色进行纯化结果鉴定,比较两种纯化方法的优劣。并最终得到纯化的蛋白,送广州瑞博奥进行抗体制备。2、IGF1R、Csk、SOCS1等蛋白的真核表达,及相互作用的鉴定提取Hela细胞的RNA,使用逆转录试剂盒得到cDNA。使用Primer 5软件、pCNDA, pENTER载体图谱及GenBank中基因序列分别设计IGF1R蛋白的β段,IGF1R全长,IGF1R-α,Csk,SOCS1,FAK,IGF1,IGFBP3, GRB10,SHC1的引物,并在引物两端加入相应的酶切位点及保护碱基。通过PCR得到目的基因。割胶回收后,将pCDNA、pENTER载体同获得的PCR产物同时进行双酶切,割胶回收酶切产物,酶切后的目的片段与载体按照7：1质量比通过T4DNA连接酶进行连接后,转入到TOP10感受态中,将细菌涂板。12h后挑去单克隆的菌落,摇菌提取重组质粒。使用酶切和测序鉴定重组质粒是否成功。将鉴定重组成功的重组载体通过脂质载体转染的方法转染到293T中进行真核表达,通过Westernblot及免疫荧光定位鉴定蛋白是否表达。参考文献及获得抗体的难易程度,我们首先选择检测IGF1R与SOCS1, IGF1R与Csk的相互作用。将重组表达成功的IGF1R-β-pENTER分别与Csk-pENTER, SOCS1-pENTER共转染与293T细胞中,通过Westernblot鉴定共表达效果。并通过改变IGF1R-β-pENTER与Csk-pENTER, SOCS1-pENTER共转染的质粒比例达到表达的IGF1R与Csk蛋白,IGF1R和SOCS1蛋白表达量达到1：1。使用COIP及荧光共定位的方法鉴定IGF1R与Csk、SOCS1的相互作用。3、初步建立IGF1R与Csk、SOCS1相互作用检测反应体系及反应条件摸索使用已经在化学发光检测体系建立了比较完整的AFP抗原和配对的AFP抗体,建立光激化学发光免疫分析检测体系。使用硼氰基化钠化学连接法将发光微球与AFP抗体1连接,AFP抗体2进行生物素化。通过改变发光微球与AFP抗体1连接的比例,生物素抗体的使用量,不同缓冲液的使用等条件,筛选最适合的反应条件。按照建立的最佳反应体系,建立基于AlphaLISA的IGF1R与通路蛋白的相互作用检测方法。将IGF1R抗体进行生物素化,将Csk抗体和SOCS1抗体连接到发光微球,检测样品为进行共转染表达IGF1R与Csk蛋白的293T细胞裂解液,共转染表达IGF1R与SOCS1蛋白的293T细胞裂解液。阴性对照中,将连接抗体的发光微球改为连接IL4R抗体的发光微球,其余成分不变。4、使用检测IGF1R与SOCS1相互作用的AlphaLISA方法检测细胞系按照上述建立的检测方法,检测Hap3,HFF-1,转染了IGF1R-β的293T细胞和共转染了IGF1R-β与SOCS1的细胞。首先收集各细胞系的细胞,然后使用缓冲液收集各细胞系总蛋白并调节蛋白浓度。还用AlphaLISA检测同一总蛋白量中,荧光信号的差异。考虑样本量的问题,再次加入4种细胞LOVO、7721、Thpl、HCT116进行检测。并尝试按照上诉方法检测IGF1R与FAK,IGF1,SHC1的相互作用。结果：成功将IGF1R-β-pMal-c2x原核表达载体重组构建成功,并在大肠杆菌中成功表达。通过镍柱亲和层析,纯化出制作单克隆抗体的原料。成功构建IGF1R-pCDNA4.0、IGF1R-β-pENTER、IGF1R-α-pCDNA3.1、 Csk-pENTER、SOCS1-pENTER、IGF1-pENTER、IGFBP3-pENTER、 FAK-pENTER、GRB10-pENTER、SHC1-pENTER等真核表达载体并在293T中得到表达。将IGF1R-β-pENTER与Csk-pENTER进行共转染表达,IGF1R-β-pENTER与SOCS1-pENTER进行共转染表达成功。通过COIP和荧光共定位鉴定IGF1R与Csk、SOCS1的相互作用。通过摸索AFP反应模式,摸索光激化学发光免疫分析检测技术,发现使用标准缓冲液优于PBS缓冲液,生物素化抗体使用最合适的浓度为0.125 μg/孔。发光微球与抗体的连接质量比例为20：3,发光微球使用浓度为2.5 μ g/孔。通过建立的检测体系检测IGF1R与Csk的相互作用,可以发现随着蛋白浓度的升高,荧光值升高,且程线性关系,R2=0.9968。检测IGF1R与SOCS1的相互作用,可以发现随着蛋白浓度的升高,荧光值升高,且程线性关系,R2=0.9983.使用已经建立的检测IGF1R与SOCS1相互作用的AlphaLISA检测Hap3,HFF.1,转染了IGF1R-β的293T细胞和共转染了IGF1R-β与SOCS1的293T细胞,发现,转染了IGF1R-β的293T细胞和共转染了IGF1R-β与SOCS1的293T细胞和Hap3中,检测的IGF1R与SOCS1相互作用较强,而HFF.1中IGF1R与SOCS1相互作用较弱。在不同的细胞系中IGF1R与SOCS1相互作用强度不同,按照作用强度从大到小：Hep3细胞>共转染IGF1R-β与SOCS1的293T细胞>单转然IGF1R-β的293T细胞>HFF.1细胞,HCT116细胞>LOVO细胞>7721>Thpl细胞。AlphaLISA方法中,检测IGF1R与FAK,IGF1,SHC1的相互作用,可以看出随着蛋白浓度不同,检测信号不同。结论：上述结果表明本研究建立的检测蛋白质相互作用光激化学发光免疫分析检测方法成功,能够检测到IGF1R与Csk,IGF1R与SOCS1, IGF1R与各通路蛋白之间的相互作用。该方法可用于其它细胞中相互作用的检测,例如Hep3,HFF.1等细胞系。这种检测方法相比于其它方法的优点有：1)使用的样品较少：AlphaLISA使用的样品600ng即可约1μ L的细胞裂解液。2)检测时间较少：AlphaLISA检测时间为30min到2h,一般30min即可检测到结果。3)步骤较少：AlphaLISA步骤只有两步即加样和检测。4)检测样品较多：AlphaLISA一次性可以检测96个孔甚至288个,检测的样品较多。5)检测的灵敏度较高：AlphaLISA可以检测到空细胞中微弱的相互作用。