脏器损伤及其专属性评判是临床中最基本、也是最重要的诊断与评判。以药物性脏器损伤为例,临床中及时发现相关的药物不良反应和毒副作用,对新药物研发和临床诊断与治疗都是十分重要的。但由于药物使用往往在诊断之后,因此鉴别损伤的因果关系或原始性损伤部位常常面临着巨大的挑战。药物性脏器损伤（Drug-induced organ injury）也被称为异物质性脏器损伤,很难与其它病原性损伤相区分。而且药物性脏器损伤同样呈现出明显的炎性损伤特征,这种特征具有明显的“损伤相关分子模式（Damage Associated Molecular Patterns,DAMPs）”。以药物性肝脏损伤为例,损伤通常有三大类:1、异物质对组织细胞的直接损伤事件;2、直接损伤后内源性代谢物的积累与蓄积,如胆汁酸,胆红素,这些内源物成为继发性细胞损伤性中间关键事件;3、由于细胞破坏所形成内源性物质或内外源性因素共同诱发体内炎性反应事件,形成免疫系统的“二次打击”,逐渐形成非感染性的脏器炎性伤害结局。整个损伤过程就是二次或多次打击的重复。由于DAMPs混杂的机制与模式,肝损伤呈现出两大特征:1、起始于非感染性炎性因素,前期是直接损伤,后期是炎性损伤,一旦进入重复或多次打击程度,其损伤特征很难回到初期的直接打击特征,表现位混合机制的多次打击特征;2、从整体上看,损伤呈现出异质性或非均匀性或非同步性,造成种属间、个体间、脏器间、细胞间的损伤差异,使损伤原因难以判定,组织的损伤专属性也难以判定。继而,损伤的判定标准因其准确性、敏感性及特异性的差异失去把控。在脏器损伤评价中,在没有明确的药物-药效因果关系,损伤评判便很难找到“药物性”的特征。药物性脏器损伤的脏器专属性评判方法包括组织病理学诊断和标志物定量分析,前者是通过组织来判定的,被视为诊断金标准,后者是评估从损伤细胞释放到体液中的某种标志物来间接推定源头组织的损伤程度。因此,标志物是否来源于某个组织,其在组织内的丰度与组织内该标志物的残余活性、以及体液中的标志物的变化关系都需要验证。同时,组织病理学诊断这一金标准也面临着诸多挑战。它是一种定性、描述性分析方法,具有主观性和客观性局限性,样本采集、医生诊断经验与偏好都会影响诊断结果。而损伤标志物因其简单明确、高选择性与可定量性等检测优势,在临床诊断中得到广泛应用。但是,组织是多特征的,而不同的标志物有各自的特征,因此,标志物缺少多特征的特异代表性,强调某一特征的特异性既是标志物的优点也是其缺点。由于在不同个体、脏器、细胞间,标志物相对分布与丰度不同,导致诊断方法的效率与标准也不同。药物损伤往往是多元特征和多机制的,血清中的某一标志物是否源于某一损伤组织除需要该组织高丰度的标志物,还应使用其它组织高丰度标志来同时加以验证。我们设想利用肝脏以外高丰度标志物结合肝脏特异性标志物进行组合,以组织形态学为比照基准,对组织样本中某一特征标志物的含量或活性进行标定,建立具有形态学多元特质的多标志物组合定量分析方法,在保证某一形态学特征或特异性存在的基础上,通过多机制标志物的组合来克服组织形态学在定量分析上的劣势,发挥其病变评判多元特异性判断上的优势,从总体上,可改善现行“金标准”的综合诊断性能。二肽基肽酶-Ⅳ（Dipeptidyl peptidase Ⅳ,DPP-Ⅳ）是一种体内多组织广泛分布的肽类水解酶,特异性水解位于肽链N端第二位置的丙氨酸或脯氨酸。体内多种活性肽类经DPP-Ⅳ水解后激活或者失活,因此,DPP-Ⅳ在体内具有多样化的病理生理机制、参与多种代谢过程,发挥着重要的调节功能。DPP-Ⅳ作为药物靶点也已有大量研究,除了作为2型糖尿病的靶点以外,也是很多癌症治疗的靶点。DPP-Ⅳ在肾脏、肠中高表达,此外于肝脏、胰腺、胎盘、胸腺等也有表达,部分以可溶形式存在于循环血液中。可溶性DPP-Ⅳ（soluble DPP-Ⅳ,s DPP-Ⅳ）仍然具有水解酶活性,是潜在的脏器损伤或验证的标志物,已受到广泛关注。因此,利用酶活性检测方法定量检测不同组织部位DPP-Ⅳ的活性,进而验证脏器损伤程度。针对以上问题,本研究展开以下工作:1、首要任务是建立特异性高、灵敏度高的DPP-Ⅳ检测方法,对正常情形下不同组织中分布的DPP-Ⅳ进行特异性活性检测,将其作为一个有效的标志物,观察正常组织的成分组成的异质性;2、以此为基础,建立标志物组织残余活性测定方法,与组织形态学评分、血清DPP-Ⅳ水平和其它标志物的变化进行比较,分析并确认血液中标志物的组织来源;3、利用两种公认的肝脏专属性化学损伤剂（ANIT和CCl4）造模,诱导大鼠发生药物性肝损伤,比较造模前后大鼠体内多种组织DPP-Ⅳ残余总活性、组织DPP-Ⅳ酶比活性、血清DPP-Ⅳ酶比活性、血清DPP-Ⅳ总活性、肝脏组织病理形态学评分、传统肝损伤标志物的血清活性及其在肝脏的组织残余活性等指标的差异,验证两种造模剂脏器损伤专属性;4、为考察大鼠肝脏不同部位的损伤程度,我们将大鼠肝脏分为四部分,分别是A叶（左大叶）、B叶（中叶）、C叶（尾状叶）和D叶（左内叶、右叶、乳头叶和乳突叶的合并样本）。比较两种药物性肝脏损伤模型中不同肝叶或取材部位间各种DPP-Ⅳ活性的异质性变化,观察因肝脏异质性导致的损伤评判结果的变化,比较血清样本与组织样本间DPP-Ⅳ活性的差异。主要研究结果如下:1、基于新探针GP-BAN经DPP-Ⅳ水解作用后将生成BAN可产生荧光,我们建立了HPLC-FD检测法。该方法的线性度、灵敏度、回收率、精密度和稳定性均得到了充分验证。其定量下限为5n M（仅需2μL）,是目前灵敏度最高的方法。方差小于15%。用不同类型单酶及特异性抑制剂证明了该探针的DPP-Ⅳ特异性,进而保证了此种DPP-Ⅳ活性检测方法可用于组织微粒体、细胞匀浆、细胞上清、血液及单酶等多体系中的DPP-Ⅳ活性的定量检测,建立了DPP-Ⅳ组织残余活性检测方法。2、DPP-Ⅳ在正常大鼠体内肾、肠、脾脏组织中呈现高活性水平的丰度,而在肝脏组织中呈现较低水平,两者相差近百倍;不同肝叶组织的DPP-Ⅳ比活性及由该部位推算的总组织活性间存在差异;3、两种肝脏损伤剂（ANIT和CCl4）均可造成血清中DPP-Ⅳ活性明显升高,说明DPP-Ⅳ是一个具有非常好的损伤区分能力的标志物;通过组织残余活性测试,我们可以基本确认s DPP-Ⅳ并非来源于肝脏,很可能是因脾脏损伤或增殖而升高。4、检测了两种肝脏损伤模型中,ANIT造成较轻的直接损伤,其中A叶取材点的DPP-Ⅳ比活性及由取材点推算的DPP-Ⅳ总肝脏活性在损伤前变异度过大,其它各叶取材点在损伤后变异度过大,造成DPP-Ⅳ活性（比活性及总活性）升降均不具有统计学意义。利用肝灌流清洗祛除实体组织中残留可溶性DPP-Ⅳ,发现ANIT致大鼠肝损伤后DPP-Ⅳ比活性升高。5、模式肝毒剂CCl4造成更明显的肝脏直接损伤,但肾脏与小肠没有变化;在肝脏内部,部分肝叶取材部位的DPP-Ⅳ比活性及由该部位推算的总组织活性在损伤前后有统计学意义的变化;CCl4同时造成脾脏DPP-Ⅳ比活性的升高与总活性下降的相矛盾趋势,虽然该数据没有统计学差异,疑似CCl4诱导免疫系统的抑制趋势,但该推断需要进一步实验证实。结论:本研究中,我们建立了DPP-Ⅳ的高灵敏度检测方法;建立了血清及组织DPP-Ⅳ残余活性测定方法;在两种公认的大鼠肝脏损伤模型中,我们发现DPP-Ⅳ对两种损伤在血清样本检测中均有非常好的损伤区分力;结合肝脏组织残余活性检测,我们发现两种大鼠肝损伤模型在损伤前后DPP-Ⅳ及传统标志物活性水平均有较高异质性,两种损伤剂的损伤类型与机理不同。DPP-Ⅳ残余活性测定也可以作为重要的脏器异质性有效判定方法,同时也是一种肝外组织是否发生损伤的反验证标志物,可甄别肝外其它组织损伤或损伤的“二次打击”或“重复性打击”是否开启的有效标志物。组织残余活性虽然因取样具有临床局限性,但该方法在基础研究中应用前景非常广泛,它对确立一种组织专属性的标志物向临床转化起关键作用。