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背景人类杯状病毒(Human Caliciviruses, HuCV)包括诺如病毒(Norovirus)和札如病毒(Sapovirus),是引起非菌性急性胃肠炎暴发的主要病因,也是仅次于轮状病毒引起婴幼儿急性腹泻的常见病原。国内自方肇寅等于1995年首次在河南腹泻患儿便样中检出诺如病毒以来,其他研究人员相继在长春、广州、兰州、太原等地先后开展了对杯状病毒的流行病学调查,结果表明杯状病毒感染在我国普遍存在,但是对于五岁以下腹泻住院儿童杯状病毒感染的分子流行特征尚缺乏系统研究。因此,系统开展杯状病毒分子流行病学研究,了解杯状病毒在我国的流行规律、流行毒株特征,对我国病毒性腹泻的预防控制工作具有重要意义。目的掌握我国甘肃地区杯状病毒的分子流行病学特点和病毒进化规律,为杯状病毒引起的病毒性腹泻防治提供科学依据。方法1.2007年10月至2008年9月,从甘肃省5个地区(兰州、白银、民勤、庆城和甘谷)收集2118份5岁以下腹泻住院婴幼儿粪便标本,采用多重RT-PCR方法检测杯状病毒,采用基因测序、系统进化和统计学方法分析杯状病毒的分子流行特点。2.通过PCR扩增杯状病毒RNA聚合酶区到3’末端的长片段(约3kb,包括ORF1聚合酶区、ORF2和ORF3),分析2004年至2008年间甘肃省杯状病毒基因的多样性,对可疑重组株进行系统进化分析和Simplot分析。结果1.2007年10月至2008年9月,甘肃省2118份腹泻样本中有131份为杯状病毒阳性,检出率为6.19%。其中诺如病毒检出率为4.86%(103/2118),札如病毒检出率为1.32%(28/2118)。12～17月龄腹泻儿童杯状病毒检出率最高(7.73%),其次是6～11月龄腹泻儿童(7.08%)和18～23月龄腹泻儿童(7.07%),24～59月龄组检出率最低(3.31%)。甘肃省5岁以下腹泻住院儿童杯状病毒感染全年均有发生,分别在2007年10月～2008年1月间,2008年6月～8月呈现出感染高峰。甘肃地区城市患儿检出率为5.66%,农村患儿检出率为6.72%。本研究获得诺如病毒毒株104株,9种基因型别。GⅠ-1基因型占3.85%(4/104),GⅠ-2基因型占9.62%(10/104),GⅠ-4基因型占0.96%(1/104),GⅠ-5基因型占3.85%(4/104)；GⅡ-3基因型占21.15%(22/104),GⅡ-4变异株2006b占52.88%(55/104),GⅡ-7基因型占4.81%(5/104),GⅡ-13基因型占0.96%(1/104),GⅡ-16基因型占1.92%(2/104)。共获得札如病毒毒株28株,5种基因型别。GⅠ-1基因型占32.14%(11/28),GⅠ-3基因型占3.57%(1/28),GⅠ-6基因型占3.75%(1/28)；GⅡ-1基因型占53.57%(15/28)；GⅣ基因型占7.14%(2/28)。2.对2004年至2008年甘肃省杯状病毒3kb序列分别进行聚合酶区和衣壳蛋白区进行系统进化分析表明,在102株诺如病毒阳性毒株中,71株毒株在两个区域分型结果一致,64株为GⅡ-4/2006b变异株,3株为GⅡ-4/Sakai株,3株为GⅡ-3基因型,1株为GⅠ-3基因型；发现29株诺如病毒在聚合酶区和衣壳蛋白区型别不一致,为可疑重组株,25株属于Sakai/GⅡ-3(聚合酶／衣壳蛋白)重组株,2株属于GⅡ-3/GⅡ-17型,1株属于GⅡb/GⅡ-13型和1株属于GⅡ-5/GⅡ-16型。2株只获得了聚合酶序列,型别分别为GⅡ-4/2006b株和GⅠ-2型。在25株札如病毒阳性毒株中,23株在聚合酶区和衣壳蛋白区分型结果一致,5株为GⅠ-1基因型,1株为GⅠ-6基因型,15株为GⅡ-1基因型,1株GⅡ-4基因型,1株为可能的新型别。2株在两区域型别不一致,为疑似重组株,包括1株GⅠ-1/GⅠ-4重组株和1株GⅡ/GⅣ组间重组株。利用Simplot重组分析软件对杯状病毒可能的重组株进一步分析分析,由于一些重组类型假定母本株缺少完整的核酸序列信息,我们只对诺如病毒Sakai/GⅡ-3重组株(代表株为43266/Lanzhou/2005株)和札如病毒GⅡ/GⅣ重组株(342074株)进行分析。根据分析结果,43266株在聚合酶区与sakai株同源性最高,在聚合酶区后,与sakai株核苷酸相似性突然降低,与Mexico株的同源性最高,重组的可能区域在729bp左右,正好与诺如病毒ORF1/ORF2重叠区对应,证实了重组的存在。利用同样的方法分析可能重组的札如病毒342074株(342074/Qingcheng/2008),342074株在聚合酶区后核苷酸相似性突然减低,342074株在聚合酶区与GⅡ型参考株的核苷酸相似性为74.0-77.6%,在衣壳蛋白区与GⅡ型参考株的核昔酸相似性只有54.0-55.2%,聚合酶区与衣壳蛋白区核苷酸相似性的差异超过20%,提示342074株极有可能发生了重组。结论1.杯状病毒是甘肃地区5岁以下住院儿童腹泻的一个重要病原,诺如病毒检出率高于札如病毒。主要感染2岁以内儿童,冬季和夏季为感染高峰。杯状病毒检出率具有地区差异。2.我国甘肃地区5岁以下住院儿童杯状病毒呈现遗传多样性特征,诺如病毒在甘肃地区存在包括GⅠ-1、GⅠ-2、GⅡ-3、GⅡ-4等9个基因型,GⅡ-4/2006b也是我国甘肃地区的流行优势株；札如病毒包括GⅠ-1、GⅠ-3、GⅠ-6、GⅡ-1、和GⅣ共5个型别,GⅡ-1基因型是流行优势株。3.通过对甘肃地区2004年～2008年间杯状病毒基因多样性分析,确定了变异株2006b已取代Sakai株成为甘肃地区诺如病毒流行优势株,重组株Sakai/GⅡ-3次之,并发现国内未见报道的重组株GⅡ-3/GⅡ-17和GⅡ-5/GⅡ-16。4.本研究发现了1株札如病毒为遗传组间重组类型,另1株毒株可能为全新的基因型。