RNAi技术已在基因功能研究和疾病治疗等方面显示出巨大的应用潜力,将其应用于抗HIV-1治疗研究是目前研究的热点。随着研究的深入,RNAi技术在抗HIV病毒的实验研究方面已经取得一些可喜的成绩。然而RNAi在治疗HIV上尚存在很多的问题。主要问题之一就是如何保证RNAi干扰片段导入细胞的效率。对大部分低等生物而言,ds RNA或si RNA导入成功率较高,但是对高等生物如哺乳动物和人类细胞株的转染成功率却不高。而且目前对HIV病毒基因RNAi的研究大部分是在体外培养的细胞中进行的,对体内细胞的作用不很明显,因此在临床上运用RNAi疗法治疗艾滋病还面临着许多的挑战。跨界基因沉默细菌(Tk-RNAi细菌)可以为将RNA干扰技术应用到临床上治疗艾滋病提供一种可行的方案。“跨界基因沉默”技术,是一种全新的、跨原核界与真核界的小分子RNA干扰传递技术。该技术利用非致病性的细菌来产生和传递具有治疗效果的sh RNA到靶细胞中去,继而引发靶细胞内特异性基因的RNA干扰。本文的研究目的是将这一跨界基因沉默干扰技术初步应用到干扰艾滋病病毒关键基因的研究中来,为研制一种以细菌为RNA干扰传递载体的抗艾滋病毒感染的新型药物提供理论依据。在研究中我们首先构建了p EB-nef-myc和p EGFP-C1-gag这两个融合表达质粒,将其分别转染SW480。Western blot蛋白印迹免疫分析技术检测nef蛋白和gag蛋白的表达情况,结果显示它们均可在SW480中表达。然后利用G418筛选建立稳定表达细胞系的方法,成功建立了稳定表达HIV-1型nef基因的SW480细胞系(SW480-nef)和稳定表达HIV-1型gag基因的SW480细胞系(SW480-gag)。随后我们分别构建了TRIP-sh RNA-nef和TRIP-sh RNA-gag跨界干扰质粒,经电击转化法转化BL21(DE3),获得Tk RNAi-nef细菌和Tk RNAi-gag细菌。通过吖啶橙染色,利用激光共聚焦显微镜观察到Tk RNAi-nef细菌和Tk RNAi-gag细菌仍然能够侵入到SW480细胞中。最后进行Tk-RNAi细菌干扰细胞蛋白表达实验,Western blot结果表明Tk-RNAi细菌可以对SW480细胞中稳定表达的HIV-l nef蛋白和gag蛋白进行有效且特异性的下调表达。