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研究背景:结直肠癌（colorectal cancer CRC）是临床上常见的消化道恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率在恶性肿瘤中均占据前三位。现阶段通过手术切除、放化疗以及靶向免疫等治疗,患者总体生存率和生活质量有所提高,但由于患者早期症状隐匿容易忽视,确诊时多数已晚期以及结直肠癌发生发展机制复杂多样性,一旦出现转移,其5年生存率将明显下降。因此探索结直肠癌的新的治疗靶点和分子调控机制将有助于结直肠癌患者早诊断早干预,为后续靶向药物开发提供理论基础。FAT10（Human HLA-F adjacent transcript 10）是目前唯一不依赖于泛素而直接经蛋白酶体降解底物的类泛素蛋白,可作为重要的蛋白翻译后修饰物。研究报道FAT10在肝癌、肺癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤中高表达,机制上与底物蛋白结合方式不同导致其功能也不尽相同,如以共价结合方式导致其结合蛋白经蛋白酶体途径降解,然而非共价结合方式则会抑制底物蛋白被泛素化从而稳定表达。虽然在结直肠癌中FAT10通过降解P53促进结直肠癌细胞增殖以及FAT10经自噬溶酶体途径促进ZO-1降解导致结肠癌转移已有报道,考虑到FAT10对底物修饰方式多样性,因此FAT10在结直肠癌具体分子机制扔需进一步研究和探索。方法:1、通过在线数据库探索FAT10在泛癌中的表达情况;利用荧光定量PCR、Western blot以及免疫组化检测FAT10在结直肠癌组织和对应的癌旁组织中的表达水平,并分析结直肠癌患者的临床病理特征以及生存信息和FAT10的表达之间关系。2、筛选结直肠癌细胞系,构建FAT10过表达和敲低稳转细胞株;通过CCK-8、平板克隆、细胞划痕、Transwell、裸鼠皮下成瘤和构建肺转移模型实验研究FAT10对结直肠癌细胞增殖、侵袭迁移能力的影响。3、利用免疫共沉淀联合质谱分析技术寻找与FAT10可能结合蛋白并确定Capn4作为下游研究分子;利用荧光定量PCR和Western blot验证FAT10对Capn4的m RNA以及蛋白表达的影响,检测结直肠癌组织中FAT10和Capn4蛋白表达水平并分析两者关系。最后通过回复实验研究Capn4是否为FAT10促进结直肠癌细胞增殖、侵袭转移的关键分子。4、利用蛋白酶体抑制剂MG132观察Capn4是否经蛋白酶体途径降解;分子模拟软件模拟FAT10和Capn4是否对接,免疫共沉淀验证两分子是否结合;放线菌酮CHX阻断蛋白合成后改变FAT10的表达观察是否影响Capn4蛋白降解速率;利用MG132阻断蛋白酶体降解功能后观察FAT10对Capn4是否存在调控,进一步免疫共沉淀观察改变FAT10的表达对Capn4泛素化水平的变化。结果:1、在线数据库发现FAT10在肝癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌、结直肠癌以及胃癌等肿瘤中表达明显高于对应的正常组织;荧光定量PCR、Western blot以及免疫组化证实FAT10在结直肠癌中表达明显高于对应的癌旁组织;分析临床病理特征和生存信息发现FAT10高表达和肿瘤的侵犯深度（T3+T4）、肿瘤大小（＞5cm）以及淋巴结阳性正相关,且FAT10高表达的患者预示更差的预后。2、筛选出FAT10相对高表达的HCT116和SW480细胞和相对低表达DLD-1细胞;慢病毒构建FAT10稳定敲低和过表达细胞株,体外细胞实验CCK-8、平板克隆、细胞划痕和Transwell实验证实干扰FAT10表达后明显抑制结直肠癌细胞的增殖、侵袭迁移能力,过表达FAT10则会促进结直肠癌细胞增殖、侵袭迁移能力;体内裸鼠皮下成瘤和构建肺转移模型动物实验结果显示FAT10敲低的细胞株裸鼠成瘤大小和肺部转移数目明显低于对照组,过表达FAT10的细胞株中裸鼠成瘤大小和肺部转移数目明显高于对照组。3、免疫共沉淀联合质谱分析技术,根据本课题组前期研究和相关文献报告将Capn4作为研究分子;Western blot和荧光定量PCR检测FAT10敲低和过表达的细胞株中发现FAT10敲低细胞株中Capn4的蛋白水平下降,FAT10过表达株中Capn4的蛋白水平上升,但不管FAT10过表达或者敲低,Capn4的m RNA水平无改变;Western blot检测结直肠癌组织中FAT10和Capn4表达,通过相关性分析发现两者正相关;回复实验中发现在FAT10敲低细胞株中上调Capn4挽救了因FAT10下调引起的细胞增殖、侵袭迁移能力的下降,FAT10过表达细胞株中干扰Capn4的表达抑制了因FAT10过表达引起的细胞增殖、侵袭迁移能力增强,证明Capn4是FAT10促进结直肠癌细胞增殖、侵袭迁移的关键分子。4、蛋白酶体途径是蛋白质重要的降解途径,在MG132阻断蛋白酶体情况下,Capn4蛋白表达随时间随渐增加,证实Capn4经蛋白酶体途径降解;分子模拟软件发现FAT10和Capn4存在对接,免疫共沉淀证实FAT10和Capn4相互结合结合;放线菌酮CHX阻断蛋白合成后,过表达FAT10可减缓Capn4的降解速度;最后在MG132阻断蛋白酶体作用下解除了FAT10对Capn4的蛋白水平调控,免疫共沉淀下发现过表达FAT10后,Capn4的泛素化水平下降,下调FAT10后,Capn4泛素化增加。结论:FAT10通过抑制Capn4的泛素化从而稳定其表达,最终促进结直肠癌细胞的增殖、侵袭迁移。