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目的探究痰液标本无细胞上清液作为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）临床驱动基因突变检测有效标本补充的可行性,并建立规范化检测流程,结合痰液细胞学病理诊断,评估痰液标本无细胞上清液肿瘤游离脱氧核糖核酸（cell free-DNA,cf DNA）进行驱动基因突变检测的准确性,以指导临床个体化治疗。材料与方法收集2018年11月至2019年6月间,北京医院经组织学或细胞学病理诊断为肺腺癌的102例患者痰液标本,以及20例非肿瘤患者痰液标本（非肿瘤痰液标本20例取自同一时期北京医院病理科接收的肺炎、慢性阻塞性肺疾病,肺心病等病例标本）。记录102例患者性别、年龄、吸烟史、临床分期等基线资料。（1）选择两种痰液去黏液化配方（mucus solution,MS）处理痰液并获取两种上清液（MS1/MS2）提取cf DNA,荧光染色标记法测量cf DNA浓度。高灵敏度测量芯片进行DNA片段分析,将两种痰液标本上清液提取cf DNA的浓度和质量进行比较,观察并评估与配对标本检测结果一致性。（2）用高效裂解缓冲技术结合硅胶膜吸附技术提取痰液标本上清液中的cf DNA;用超级突变阻滞扩增系统（super Amplification Refractory Mutation System,super-ARMS）法检测EGFR基因的突变状态,与其配对肿瘤标本基因检测结果比对观察一致性,计算灵敏度,特异度,阳性预测值（positive predictive value,PPV）,阴性预测值（negative predictive value,NPV）。（3）选择其中一代至三代表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂（Epidermal Growth Factor Receptor-Tyrosine Kinase Inhibitors,EGFR-TKIs）耐药患者的痰液标本上清液提取的cf DNA,用super-ARMS法同时检测20号外显子T790M突变以及原有敏感突变类型,检测结果与配对肿瘤标本检测结果进行比对观察一致性。（4）选择30例痰液标本无细胞上清提取的cf DNA,用二代测序（Next Genomic Sequencing,NGS）进行肺癌相关10基因突变检测,观察与配对肿瘤标本驱动基因突变检测结果一致性,计算灵敏度及特异度、阳性预测值、阴性预测值。结果（1）102例肿瘤患者痰液标本中男性48例,女性54例,年龄29-89岁,平均年龄65岁。临床分期I-IIIA期患者39例。IIIB-IV期患者63例,经统计学分析,EGFR突变型与EGFR野生型患者在年龄、性别、吸烟情况、临床分期、取材方式等方面无显著性差异。（2）两种化痰液处理后的痰液上清中,MS2处理后DNA浓度均值为32.48 ng/?l,MS1处理后DNA浓度均值为2.44 ng/?l;从浓度上比较MS2显著高于MS1,且有统计学差异。两种痰液标本上清液cf DNA Super-ARMS检测特异性均为100%,MS2处理后检测灵敏度为75%,而MS1处理后检测灵敏度为50%,显示经MS2处理后检测灵敏度高于MS1处理后的标本,且具有统计学差异（P<0.05）。（3）经super-ARMS法检测,痰液标本上清cf DNA检测灵敏度46.15%（30/65）,特异度100%（37/37）,阳性预测值100%,阴性预测值51.39%;其中I-IIIA期患者检测灵敏度为24%,而IIIB-IV期患者检测灵敏度为65%;配合痰液细胞学病理检测结果,I-IIIA期患者检测灵敏度提高到66.67%,而IIIB-IV期患者的灵敏度提高到100%。在非肿瘤患者痰液标本上清cf DNA中,痰液Super-ARMS检测EGFR突变为阴性,检测特异性为100%（20/20）。（3）34例EGFR-TKIs耐药患者配对标本均携带原有EGFR敏感突变,其中T790M突变型11例,野生型23例;痰液标本上清cf DNA中EGFR基因敏感突变检出率55.9%（19/34）,其敏感突变均与配对标本敏感突变类型符合,其中液基细胞学评估为阳性痰液标本检出率为100%（10/10）,合格痰液标本的检出率为52.9%（9/17）;所有检测出T790M突变的标本均检测出原有敏感突变,总体T790M突变检出率为29.4%（10/34）,其中液基细胞学评估为阳性痰液标本的检出率为50%（5/10）,合格痰液标本检出率为29.4%（5/17）。与配对标本T790M检测结果比对,总体检测灵敏度为45.5%（5/11）,特异度78.3%（18/23）。对于EGFR-TKIs耐药并出现T790M突变的患者,补充痰液标本上清液提取cf DNA进行检测,可以使T790M阳性检出率提高14.7%（5/34）。（4）经NGS检测30例痰液上清提取cf DNA标本中,2例非肿瘤痰液标本分别检测出KRAS突变1例,PIC3KA突变1例;在28例诊断为NSCLC患者痰液标本中,其配对标本驱动基因检测结果:野生型10例,含驱动基因突变型18例;痰液标本上清液提取cf DNA进行NGS检测结果中,共14例检测结果与配对标本驱动基因突变结果一致,检测灵敏度77.8%（14/18）,特异度100%（10/10）,阳性预测值100%,阴性预测值75%。结论（1）痰液标本无细胞上清液可以作为临床驱动基因突变检测的标本类型之一,而且临床晚期患者较早中期患者更适宜应用痰液进行检测。结合痰液细胞学病理诊断,找到肿瘤细胞的痰液标本所提取上清液更适宜进行驱动基因检测。（2）在不影响痰液标本诊断的同时,无甲醇去黏液配方（MS2）处理后得到的上清提取cf DNA在浓度、质量、检测结果一致性方面优于传统含甲醇去黏液配方（MS1）。（3）EGFR-TKIs耐药患者的痰液标本上清液可作为临床有效补充标本应用于临床基因检测,可以指导临床进行个体化用药调整。（4）痰液标本上清液在合理质控的条件下可以作为NGS检测的合格标本,同时非肿瘤患者在痰液标本和DNA质控合格前提下,也可满足NGS检测要求。