第一部分多巴胺的递质传递及Percoll密度梯度离心法制备突触体目的:(1)掌握多巴胺递质突触传递的完整过程,明确各传递环节的意义,为后期的实验研究提供理论支撑;(2)了解国内外突触体制备方法及发展历史,总结各时期关键技术步骤,并纵向比较各种方法的优缺点,掌握突触体制备的核心技术,为实验研究提供技术支持。方法:通过文献搜集分析及技术探索,掌握多巴胺递质突触传递的完整过程,总结突触体制备技术的发展概况,采用Percoll密度梯度离心法制备突触体,透射电镜观察其形态和结构完整性。结果:多巴胺系统是探索ADHD发病机制的重点,多巴胺递质突触传递是包括递质合成、储存、递质转运、释放及失活在内的复杂过程,各个环节的异常均能够影响脑内多巴胺的水平。而突触体制备技术经历了经典的蔗糖密度梯度法→经典改进方法→Ficoll/sucrose法→不连续性Percoll密度梯度离心法四个关键技术阶段,Percoll密度梯度离心法为当前国际最新技术,国内尚未有专业技术报道,课题组采用该技术制备的突触体拥有突触前膜、突触间隙、突触后膜,结构完好,突触体分布密度较高,具有典型突触体形态结构。结论:多巴胺递质突触传递中生成、释放、转运、清除的各个环节均是在突触体内相应介质的介导下完成,从突触水平研究多巴胺递质突触传递对脑内多巴胺水平的影响大有可为。突触体是进行神经生理、生化、药理和毒理研究的基础,了解并掌握不同阶段突触体制备技术是深入开展脑部疾病及脑内神经递质分子水平研究的基础,值得深入学习并掌握。而课题组所掌握的突触体制备技术具有耗时少,产出率高的优势,所制备突触体结构完整、形态典型,弥补了传统技术的不足,为神经系统疾病的研究提供技术支持。第二部分安神定志灵对调控多巴胺生成、释放及清除的信号通路的影响目的:研究安神定志灵对ADHD模型SHR大鼠突触体多巴胺生成、释放及清除环节相关因子及信号通路的影响,探索安神定志灵治疗ADHD的药效机制。方法:依据随机数字将40只SHR大鼠分为模型组,西药组,安神定志灵低、中、高剂量组,每组8只,另设WKY大鼠8只设为正常组,分别灌胃4周。Percoll密度梯度离心法制备脑突触体作为实验标本,电镜观察突触体形态结构,比色法检测突触体内ATP酶、乳酸脱氢酶活性,选择运用实时定量PCR、免疫蛋白印迹、酶联免疫吸附实验、免疫组织化学法及荧光法等技术检测SHR大鼠突触体内TH、DDC、AC/cAMP/PKA、VMAT2、SNAP25、Synataxinla、ERK1/2、CAMKII等相关指标的表达情况。结果:实验所提取突触体结构完整,具有酶活性,符合相关要求。安神定志灵中剂量组可显著提高突触体ATP酶活性、显著降低LDH酶活性(P<0.01);安神定志灵中剂量组突触体内AC、cAMP、PKA含量均有一定升高(P<0.05),安神定志灵高剂量组AC、cAMP含量亦有升高(P<0.05);安神定志灵低剂量组TH、DDCmRNA表达水平有所上升(P<0.05),安神定志灵中剂量TH、PKAmRNA表达水平升高明显(P<0.01),高剂量组无统计学差异。中剂量组显著提高TH、DDC阳性细胞数;安神定志灵中剂量组对SNAP25、VMAT2及Synataxinla表达具有显著的上调作用(P<0.01);安神定志灵可显著影响ERK1/2及CaMKII信号通路,调控信号通路的表达,且以中高剂量效果最为明显。结论:安神定志灵可提高突触体内ATP酶活性、显著降低LDH酶活性,对突触体具有一定保护作用。安神定志灵能够上调AC/cAMP/PKA的表达水平,同时提高TH、DDC的表达量及阳性细胞数,加速多巴胺的合成速度;通过对参与多巴胺转运、释放的VMAT2、SNAP25、Synataxinla的上调作用,并通过调控CAMKII及ERK1/2蛋白功能,加速多巴胺囊泡外排进程,降低清除效率,以提高突触间隙内的多巴胺浓度,从而提高突触间隙多巴胺含量,改善多巴胺缺陷状态。安神定志灵对多巴胺递质突触传递中生成、释放、转运、清除的各个环节相关因子均有一定程度的调控作用,尤以中剂量效果显著。第三部分黄芩苷调控ADHD核心症状的疗效及其初步机制探讨目的:研究安神定志灵主要有效成分黄芩苷调控ADHD核心症状的疗效,探索其初步药效机制。方法:将40只SHR大鼠随机分为模型组、盐酸哌甲酯组及黄芩苷低、中、高剂量组,每组8只,另设8只WKY大鼠为正常对照组。盐酸哌甲酯组(0.07 mg/mL)及黄芩苷低剂量(3.33 mg/mL)、中剂量(6.67 mg/mL)、高剂量(10 mg/mL)组分别按体重(1.5 mL/100 g)给予相应药物灌胃,WKY组、模型组给予相同量的生理盐水灌胃,各组大鼠灌胃4周,每日2次。每日记录大鼠体重及进食量的变化,旷场实验观察实验第0天及灌胃后7、14、21、28 d各组大鼠的总运动距离及平均运动速度,评估药物对大鼠多动、冲动行为的控制作用;Morris水迷宫实验观察各组大鼠的潜伏期、目标象限活动比率及穿台次数,评估药物对大鼠注意力的影响。Percoll密度梯度离心法制备脑突触体,选择性运用Western blot、PCR、ELISA、比色法等技术检测突触体内 ATP、LDH、AC、cAMP、PKA、SNAP25、VMAT2、Synataxinla等指标的表达情况;高效液相色谱法检测大鼠前额叶、纹状体DA的含量。结果:黄芩苷不影响大鼠的体重及进食量。旷场实验数据显示,盐酸哌甲酯组及黄芩苷高剂量组大鼠较模型组大鼠在总运动量及平均运动速度上均显著降低(P<0.05)。水迷宫空间探索实验结果显示,盐酸哌甲酯组及黄芩苷中、高剂量组在目标象限停留时间比率较模型组显著增高(P<0.05),盐酸哌甲酯组、黄芩苷高剂量组在目标象限运动距离上所占比率较模型组亦显著升高(P<0.05);黄芩苷高剂量组穿台次数高于其余各组(P<0.05),优势明显。黄芩苷能够调节突触体ATP酶、LDH活性,且低、中、高剂量组均能升高AC、cAMP、PKA含量(P<0.01),较西药组升高明显。盐酸哌甲酯及黄芩苷高剂量均能够显著上调SNAP25、VMAT2及Synataxin la蛋白的表达(P<0.05或P<0.01)。黄芩苷中、高剂量组能够提高纹状体多巴胺含量。结论:黄芩苷不影响大鼠的正常生长,黄芩苷能够调控ADHD模型SHR大鼠的运动能力及学习记忆能力,从而能够控制SHR大鼠多动、冲动、注意力不集中的ADHD核心症状;这一作用机制可能与黄芩苷可调节模型大鼠突触体ATP酶、LDH活性,提高突触体内AC、cAMP、PKA含量,上调SNAP25、VMAT2及Synataxinla蛋白及mRNA的表达,从而影响纹状体多巴胺的含量有关。黄芩苷药效呈剂量依赖性,高剂量组疗效最为显著,但其药效的发挥迟于盐酸哌甲酯。