论文部分内容阅读
近年来研究发现序列特异性靶向某些靶基因启动子区的双链小RNAs(dsRNAs)能引起人肿瘤细胞内靶基因转录水平的表达上调,并将此现象命名为RNA诱导的基因激活(RNAa),称这样的dsRNAs为小激活RNAs (saRNAs).随后关于RNAa发生机制方面的研究显示表观遗传学修饰和反义转录产物与RNAa的发生密切相关。然而,目前对RNAa的普遍性、作用机制以及设计原则的了解仍较肤浅,且在RNAa的发生机制方面存在一些争议。本研究旨在探讨RNAa现象的普遍性、明确其具体发生机制、完善saRNAs的设计规律以及评估其治疗应用的可行性,主要研究内容及成果如下:1)本文针对肿瘤抑制基因p21、par-4、KAI1和NKX3-1基因启动子区设计了若干对双链小RNAs,利用RT-PCR反应和蛋白印迹验证及挑选了能有效上调靶基因表达的功能性saRNAs:dsP21-306和dsPar4-435;并发现功能性saRNAs的有效性是由dsRNAs的设计位点和细胞本身的遗传背景及特征共同决定的。2)比较功能性saRNAs邻近位点的dsRNAs与功能性saRNAs在调节靶基因表达方面的异同,发现功能性saRNAs的靶点沿基因启动子区序列向上游或下游位移1~2个碱基能获得1~2对新的功能性saRNAs。同时,结合以往发现的功能性saRNAs,分析总结它们的序列特征,发现其正义链3’端碱基具有一定的规律,可能与其功能有关。3)利用染色质免疫共沉淀探讨功能性saRNAs对par-4启动子区表观遗传学修饰的影响,发现dsPar4-435作用靶点附近的染色质H3K9二甲基化减少和H3K4二甲基化增加,而H3K9的乙酰化状态无明显改变,提示表观遗传学修饰的变化趋势虽与RNAa现象一致,但是其具体改变可能因基因的不同而存在一定的差异。利用PCR检测提示各种细胞中par-4基因启动子区均存在转录产物,以反义RNA为主,它在dsPar4-435作用后表达略有上升,但确切的作用机制仍需进一步研究探索。4)利用MTT法、流式细胞术以及蛋白印迹等评估功能性saRNAs对膀胱癌细胞的体外治疗作用和效果,发现dsP21-306和dsPar-435上调靶基因表达后均能有效诱导T24细胞的凋亡,dsP21-306还能诱导G1期细胞周期阻滞,从而抑制膀胱癌细胞的生长,说明saRNAs上调基因表达对膀胱癌具有一定的治疗效果和应用前景。总之,RNAa现象具有一定的普遍性,其作用机制与表观遗传学修饰和反义转录产物有一定的联系;同时,saRNAs对膀胱癌细胞的体外治疗效果明显,为将来恶性肿瘤及其他疾病的临床治疗应用提供了理论依据。但是,RNAa现象的确切机制、设计规律以及治疗应用的体内实验等工作还需进一步研究完善。