酿酒酵母利用木质纤维素原料生产燃料乙醇是生物燃料生产的重要研究方向,但木质纤维素预处理常产生多种抑制物,浓度高的抑制物可强烈抑制酿酒酵母生长以及乙醇发酵效率。乙酸是水解液中普遍存在的抑制物之一,高浓度的乙酸会严重抑制乙醇发酵过程中酿酒酵母生长及乙醇发酵性能。此外,燃料乙醇发酵过程中酿酒酵母细胞还会受到其他环境胁迫因素的影响,包括高温、低p H、高渗透压、氧化胁迫和纤维素水解液中其他抑制物的毒性等。因此,构建具有较强环境胁迫耐受性的酵母菌株对纤维素乙醇发酵效率的提高具有重要意义。本课题组前期结果表明,乙酸胁迫存在条件下,适量硫酸锌添加可显著提高酿酒酵母乙酸胁迫耐受性。转录组分析表明,硫酸锌添加后,与氨基酸代谢和嘌呤合成途径相关的精氨酸水解酶基因CAR1和5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸甲酰转移酶基因ADE17的表达明显上调。进一步研究表明,过表达这两个基因可提高酿酒酵母环境胁迫耐受性,但其提高机理以及这两个基因表达与锌稳态之间的调控关系目前还不清楚。为进一步构建环境胁迫耐受性良好的酿酒酵母工程菌,以及探讨酿酒酵母中锌响应相关基因对胁迫耐受性的调控机制,本文进一步研究了CAR1和ADE17对酿酒酵母耐受性的影响,并研究了酿酒酵母锌状态响应转录因子Zap1p与这两个基因的调控关系。本文首先对CAR1过表达提高酿酒酵母乙酸耐受性的分子机理进行了分析。发现在乙酸胁迫条件下,CAR1过表达菌株细胞膜完整性和胞内ATP含量得到提高,推测该基因的过表达缓解了乙酸积累造成的胞内酸化。Com2p是Zap1p的潜在靶基因,因此继续研究了COM2及其编码产物在CAR1启动子上的结合位点破坏对乙酸耐性的影响。结果表明,在BY4741中敲除COM2或破坏Com2p在CAR1启动子区的结合位点后,突变株在乙酸胁迫条件下的生长均受到抑制,其中Com2p结合位点突变体的抑制更为明显,推测转录因子Zap1p有可能通过Com2p调控CAR1转录。其次,研究了ADE17过表达对多种环境胁迫耐受性的影响和调控机理。在添加多种不同抑制物的条件下,与过表达其他功能基因的菌株相比,过表达ADE17的重组菌株BADE17表现出最优的耐受性。进一步通过驯化提高BADE17菌株的抑制物耐受性,发现在混合抑制物条件下驯化得到的菌株BADE17-2和BADE17-4菌株的延滞期与BADE17相比缩短了23 h。此外,根据锌响应转录因子Zap1p对ADE17的调控分析,发现在乙酸胁迫条件下,ZAP1表达下调,ADE17表达上调,推测Zap1p对ADE17可能存在负调控作用。当ZAP1敲除后,ADE17的表达受到明显抑制,推测ZAP1的下调会激活ADE17的表达,但ZAP1的敲除又会影响其它基因对ADE17的调控。对ADE17基因上游预测的Zap1p结合位点进行突变并检测ADE17的转录水平发现,无论在无胁迫还是乙酸胁迫条件下,与野生型相比,突变体的ADE17转录水平均上调,从而进一步验证了ZAP1对ADE17的负调控作用。本文对锌响应基因CAR1和ADE17对酿酒酵母环境胁迫耐性的影响,以及锌状态响应转录因子Zap1p对这两个基因的表达调控进行了研究,所取得的结果有助于深入理解硫酸锌添加对酿酒酵母乙酸胁迫耐受性的调控机制,并为进一步构建环境胁迫条件下发酵性能优良的菌株、提高木质纤维素乙醇的发酵效率提供了基础。