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研究背景：肺动脉高压是以肺血管阻塞性病变导致肺血管阻力进行性升高为特征的严重肺血管疾病。其主要病理改变是外周肺小动脉中膜增生肥厚,肺小血管闭塞和肺细小动脉丛样病变。而高动力性肺动脉高压主要是由于体-肺分流的异常血流动力学引起,为先天性心脏病患者最常见的并发症,也是影响患者生存和生活质量非常重要的因素,随着病情进展,临床处理困难,致死率极高。目前扩血管药物对肺动脉高压治疗的长期疗效无法令人满意,而干细胞移植的血管新生治疗方式已经在各个疾病的研究领域取得了新进展。内皮祖细胞是一类存在于外周血与骨髓中,并且能够增殖分化为成熟血管内皮细胞的前体细胞,它能够结合到缺血或者损伤的内皮部位参与新生血管的形成,另外内皮祖细胞移植对于缺血缺氧性疾病治疗的远期疗效已经得到了证实。低氧诱导因子(HIF-1)是广泛存在于体内能够参与血管新生的转录因子,在机体缺氧时能够增加血管床的数量从而改善缺血缺氧,其生物活性主要取决于HIF-α亚基。内皮祖细胞和低氧诱导因子对于改善组织缺血缺氧有协同作用,因此我们推测,在体外,通过慢病毒介导将HIF-1α转染入内皮祖细胞,高表达HIF-1α的内皮祖细胞移植入体内能够协同参与新生血管的形成、减轻肺动脉高压并且逆转肺动脉血管重构,从而为先天性心脏病肺动脉高压患者未来的基因和干细胞治疗提供理论依据。目的：1.探讨并构建一种可靠、稳定、经济的高动力性肺动脉高压模型,并确定能够成功建立可逆或者不可逆的肺高压模型的时间,为肺高压的进一步研究奠定基础。2.利用密度梯度离心法分离培养骨髓来源的内皮祖细胞并纯化鉴定,为内皮祖细胞移植提供条件。3.构建并鉴定人HIF-la (hHIF-1α)慢病毒表达载体,慢病毒介导hHIF-1α体外转染内皮祖细胞,确定最佳感染复数(MOI)及转染效率并观察转染后内皮祖细胞在低氧环境下的生长状态和hHIF-1α的表达。4.将高表达hHIF-1α的内皮祖细胞经静脉途径移植到高动力肺动脉高压模型兔体内,观察肺血管血流动力学和肺组织病理变化,探讨单纯内皮祖细胞移植和高表达hHIF-1α的内皮祖细胞移植对肺动脉高压的不同影响,证实其对肺高压治疗作用的血管新生机制。方法：1.取1月龄新西兰白兔进行颈总动脉-颈内静脉套管法和直接缝合吻合法两种分流手术,比较两种分流手术方式的优缺点。手术后1、2、3、6和12个月,通过右心导管术分别测量肺动脉收缩压和平均肺动脉压,为了排除套管和缝合吻合的分流对肺动脉压力的影响,我们在分流血管夹闭前后分别测定肺动脉压力。称量右心室和左心室+室间隔重量,计算右心室和左心室+室间隔重量的比值[RV/(LV+S)]来评估右心室肥厚程度。动物处死后制作肺组织病理切片,HE染色观察肺血管病理形态变化并通过Heath-Edwards分级方法进行评价,观察术后不同时间段各组肺血管病理形态及Heath-Edwards分级情况,从而确定分流手术后导致的可逆或者不可逆肺动脉高压形成的时间。2.取新西兰白兔双下肢股骨骨髓,淋巴细胞分离液梯度离心后,取中间云雾状单个核细胞进行细胞培养,EGM-2内皮祖细胞专用培养基培养单个核细胞并进行传代纯化。体外培养细胞,观察细胞不同时间的形态,通过流式细胞仪检测培养细胞的CD34. CD133和VEGFR-2表面抗原表型,Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-1荧光染色法鉴定细胞的双吞噬功能。同时用CM-DiL标记细胞,观察细胞标记率以及标记后对细胞生长的影响,为后续实验奠定基础。3.根据NCBI数据库中hHIF-1α序列设计引物,以hHIF-1α cDNA作为模板做PCR扩增,NheI和BamHI双酶切重组克隆hHIF-1α质粒和空白载体。参照Invitrogen公司ViraPower慢病毒包装系统的方法进行hHIF-1α慢病毒的包装,并测定慢病毒滴度。取培养2周的EPCs传代于6孔板中,细胞生长满意后进行病毒转染。按照MOI值=0、5、10、20、50、100、200分别加入慢病毒液,同时加入Polybrene (8μg/ml),置于37℃低氧培养箱中(1%02,5%_CO2和94%N2)培养。培养48-96小时后倒置相差显微镜观察细胞生长状态,倒置荧光显微镜下观察阳性细胞数,计算转染效率,确定最佳MOI值。转染成功后,Western blot检测hHIF-1α在EPCs中的表达情况。4.新西兰白兔按照颈总动脉-颈内静脉吻合的方式建立高动力性肺动脉高压模型,术后4、8和12周分别做超声心动图检测吻合口的通畅度及心功能情况,12周后均通过右心导管术检测肺动脉压力。所有成功建立肺动脉高压模型和假手术组的新西兰白兔被随机分为6组,每组10只。假手术组：仅颈总动脉和颈内静脉分离；空白对照组：建立肺动脉高压模型后不做任何处理；EPCs组：通过左侧颈内静脉行单纯EPCs移植；hHIF-1-EPCs组：通过左侧颈内静脉行转染后高表达hHIF-1α的EPCs移植；EPCs对照组：通过左侧颈内静脉行转染空载体的EPCs移植；培养基组：仅通过左侧颈内静脉向模型兔注射EGM-2培养基。2周后通过右心导管术检测血流动力学指标,处死动物后行肺组织病理切片,HE染色观察肺血管病理变化,计算肺小动脉的管壁厚度指数及相对管壁面积指数。冰冻切片行免疫荧光检测观察移植的EPCs在肺组织中的分布,Western blot检测肺组织hHIF-1α的表达。通过免疫组织化学染色检测肺组织Ⅷ因子以观察各组肺组织毛细血管密度,明确EPCs和转染hHIF-1α的EPCs移植对肺血管数量的影响。结果：1.套管组建立模型从麻醉到结束的平均手术时间为1.40±0.12h,吻合组为1.48±0.21h。套管组的死亡率为27.5%(11/40),吻合组死亡率为12.5%(5/40)。手术后2个月至12个月,与假手术组相比,套管组和吻合组在分流血管夹闭前均有明显增高的肺动脉收缩压、平均肺动脉压和RV/(LV+S)(P<0.05)。虽然分流血管夹闭后,肺动脉压力有所下降,但是肺动脉收缩压和平均肺动脉压力仍明显增高于假手术组(P<0.05)。而套管组和吻合组的肺动脉收缩压、平均肺动脉压和RV/(LV+S)无明显差异。通过Heath-Edwards分级发现,与假手术组相比,套管组和吻合组肺组织在术后3个月出现可逆肺动脉高压病理改变,6个月后出现不可逆肺动脉高压病理改变。2.梯度离心法分离骨髓单个核细胞培养,24小时开始贴壁,培养7天后细胞可形成典型集落,2周以后即出现克隆性生长的EPCs。流式细胞仪检测细胞表面CD34、CD133和VEGFR-2的阳性表达均占80%-95%,双荧光染色可见90%的贴壁细胞都能够特异性的摄取Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-1。CM-DiL标记细胞2天后,倒置荧光显微镜可见95%的细胞胞浆和胞膜均被染成红色,少量次数传代后红色荧光无明显衰减,并且标记对细胞生长无明显影响。3. hHIF-1α慢病毒表达载体构建并包装后,转染293TN细胞可见明显绿色荧光,测慢病毒滴度：hHIF-1α慢病毒为1.5×107TU/ml,对照空载体慢病毒为5×108TU/ml。不同MOI转染EPCs后,用倒置相差显微镜和荧光显微镜观察发现,MOI=100时,转染效率最高,约为90%以上,并且细胞生长良好,无明显死亡,多次传代后能够稳定表达。慢病毒转染EPCs96小时后行Western blot,转染hHIF-1α的EPCs组可见hHIF-1α蛋白表达,未转染和空载体对照组无hHIF-1α表达,证明hHIF-1α已经成功转染至EPCs中。4. hHIF-1α转染的EPCs移植后2周,与假手术组相比较,空白对照组和培养基组肺动脉收缩压、平均肺动脉压和RV/(LV+S)明显增高(P<0.05)(假手术组分别为：13.3±1.636mmHg,8.97±1.356mmHg和0.247±0.021;空白对照组分别为：35.4±2.066mmHg,23.1±1.331mmHg和0.436±0.034；培养基组分别为：35.9±2.132mmHg,23.4±1.389mmHg和0.433±0.026)。空白对照组和培养基组之间无明显差异。与空白对照组相比,EPCs组和hHIF-1-EPCs组的肺动脉收缩压、平均肺动脉压和RV/(LV+S)明显降低(P<0.05)(EPCs组分别为：24.5±4.301mmHg,17.3±2.908mmHg和0.353±0.056; hHIF-1-EPCs组分别为：15.4±1.897mmHg,10.3±1.515mmHg和0.278±0.029),但是hHIF-1-EPCs组比EPCs组降低更明显(P<0.05)。EPCs组和EPCs对照组之间无明显差异。冰冻切片显示肺组织中EPCs组的EPCs可呈现红色荧光,hHIF-1-EPCs组的EPCs可呈现绿色荧光。结果显示2周后移植的EPCs主要定位于毛细血管周围和肺泡周围,并且有的已经形成了小血管样明显环状结构。肺组织Western blot检测,hHIF-1-EPCs组出现hHIF-1α特殊表达的条带,其余组均未见明显条带出现。肺组织病理切片HE染色观察,与假手术组相比,空白对照组和培养基组的管壁厚度指数和相对管壁面积指数明显增大(P<0.05),但空白对照组和培养基组之间无明显差异。与空白对照组相比较,EPCs组和hHIF-1-EPCs组的管壁厚度指数和相对管壁面积指数明显降低(P<0.05),但是hHIF-1-EPCs组比EPCs组降低更明显(P<0.05). EPCs组和EPCs对照组之间无明显差异。免疫组织化学检测Ⅷ因子,移植后EPCs组、hHIF-1-EPCs组和EPCs对照组毛细血管密度比空白对照组明显增大(P<0.05)(EPCs组：4.50±1.354/mm2; hHIF-1-EPCs组：8.20±1.814/mm2;EPCs对照组：4.30±1.337/mm2；空白对照组：2.30±1.494/mm2),并且hHIF-1-EPCs组血管密度增大更明显(P<0.05)。结论：1.颈总动脉-颈内静脉吻合能够成功建立可靠、稳定、经济的兔高动力性肺动脉高压模型,术后3个月左右可以形成可逆性肺动脉高压,术后6个月以后可以形成不可逆肺动脉高压。2.利用密度梯度离心法可以体外分离骨髓来源的单个核细胞,并且通过EGM-2培养基能够定向诱导、传代获取大量的纯化和稳定增殖的EPCs.3.当MOI=100时,慢病毒载体能以高转染效率将hHIF-1α和GFP基因成功转染于兔EPCs中,并且细胞生长良好,能够长期稳定表达。4.hHIF-1α联合EPCs移植能够有效的减轻肺动脉高压、逆转肺血管的重构,其主要机制是促进肺组织血管新生、增加肺血管床密度,从而减轻了肺循环阻力。