伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus，PRV)引起多种家畜与野生动物以发热，奇痒，脑脊髓炎，流产及死亡为主要特征的急性传染病。猪是该病的贮存宿主和主要传染源，猪感染PRV后常表现为哺乳仔猪死亡、育肥猪生长停滞及妊娠母猪繁殖障碍。该病在欧洲、亚洲等多个国家呈蔓延趋势，已给世界养猪业带来了巨大的经济损失，中国尤为严重。PRV属于双链DNA病毒，大小约150 Kb，可编码70-100种蛋白质，其中EP0蛋白是PRV重要的早期蛋白。EP0蛋白包含与锌指结构类似的环指结构域，该结构域主要是结合DNA、RNA及蛋白质之间相互作用的区域，推测它在病毒与宿主相互作用方面具有重要意义。本研究构建了pGBKT7-EP0诱饵质粒和PK-15细胞cDNA文库，为更好的研究PRVEP0蛋白与宿主细胞PK-15之间的相互作用机制提供基础。具体研究内容如下:　　第一部分:构建pGBKT7-EP0诱饵质粒　　采用PCR技术，扩增获得PRV EP0基因，将其克隆至酵母双杂交载体pGBKT7中，获得重组诱饵质粒pGBKT7-EP0，通过限制性内切酶EcoRⅠ与PstⅠ双酶切鉴定与基因测序结果分析，表明成功构建诱饵质粒pGBKT7-EP0。将该质粒转入到Y2HGold酵母感受态细胞中，对其进行毒性检测，自激活效应检测，PCR以及Western-blot检测，结果表明诱饵质粒表达的产物对酵母细胞无毒性作用，无自激活效应，PCR和Western-blot检测结果证实诱饵质粒pGBKT7-EP0成功转入酵母细胞，并且能够表达融合蛋白BD-EP0-Myc。　　第二部分:PK-15细胞cDNA文库构建及鉴定　　选取PRV的宿主细胞PK-15细胞来构建酵母双杂交cDNA文库。本试验从PK-15细胞提取总RNA，采用SMART和LD-PCR合成全长的dscDNA，并对其进行均一化和SfiⅠ酶切处理。将得到的ds cDNA连接到三框表达载体中。将这三个重组反应产物用电转化方法转入到HST08电转化感受态细胞中，构建含有三种读码框的初级文库，该文库库容分别为3.0×106、2.0×106和2.0×106 CFU，插入片段均在500 bp以上，阳性重组率均大于93％。再将三框初级文库共同电转化至感受态细胞HST08中进行扩增，提取质粒文库。最后将质粒文库转化到Y187酵母感受态细胞，得到的cDNA酵母文库总库容量为7.5×105 CFU，基本符合酵母双杂交cDNA文库构建要求。　　综上，本课题成功构建了符合酵母双杂交筛选要求的诱饵质粒pGBKT7-EP0和酵母cDNA文库，为进一步研究PRV EP0蛋白与PK-15细胞蛋白之间的相互作用奠定了基础。