第一部分 表观遗传分子抑制剂对干扰素抗肿瘤免疫应答的增强作用及其机制研究与基因突变相比,肿瘤发生的过程中更加常见的原因之一是发生启动子区域CpG序列的甲基化增多,抑制了抑癌基因的表达。基因组中DNA甲基化是指DNA分子上添加上了甲基基团。其中,启动子区域甲基化在肿瘤的发展过程中非常关键,很多抑癌基因(TSGs)的表达都会因此而降低。在肝细胞肝癌(HCC)中,CpG区域甲基化程度的建模能够相对准确地预测患者的生存期。DNA甲基化酶抑制剂在肿瘤治疗中的应用能够使肿瘤的增殖减缓,增加肿瘤细胞的凋亡。近年来,随着肿瘤免疫治疗的研究深入,DNA甲基化酶抑制剂能够通过增加肿瘤细胞的免疫原性,提高肿瘤免疫治疗的效果。其中,使用DNMTi抑制剂Azacitidine(5-Aza)可以增加免疫原性基因的表达升高,激活下游I型干扰素应答。肿瘤中高度甲基化的内源逆转录病毒片段(ERVs)的CpG区域去甲基化后表达升高能够通过胞内dsRNA识别通路活化下游干扰素和炎症信号通路。干扰素下游信号通路的活化能够调节肿瘤细胞本身的免疫炎症状态,而机体的免疫系统是否能有效地识别和清除肿瘤细胞,取决于肿瘤细胞能够发出激活还是抑制的信号。本部分的研究首先通过肝癌组织的mRNA芯片筛选了在肿瘤组织中高表达的DNMT1和HDAC3表观修饰酶,并且用IFN-α处理肿瘤细胞后发现这两个表观修饰酶的表达降低。以上结果提示抑制上述表观修饰酶的表达可能会促进IFN-α治疗肿瘤的效果。因此,我们使用DNMTi或HDACi抑制剂联合IFN-α处理肝癌细胞,发现肿瘤细胞中ISGs的表达较单用IFN-α组有显著升高。同时,我们发现DNMTi或HDACi抑制剂也能刺激肿瘤细胞中的内源性抗原ERVs和CTAs的表达,增强肿瘤的免疫原性。通过蛋白信号通路的检测,我们发现与单用IFN-α组相比,DNMTi或HDACi抑制剂可以增加干扰素相关信号通路STAT的磷酸化水平。我们进一步利用siRNA干扰DNMT1或HDAC3的表达,验证了这两个表观修饰酶能够调控ISGs及内源性抗原的表达。同时,通过ChIP实验验证了抑制剂对细胞的处理能够影响ISGs和内源性抗原基因的TSS位点的H3K27me3的甲基化修饰,进一步检测发现H3K27me3的甲基化修饰改变还发生在与肿瘤细胞干细胞性相关的基因上。细胞功能学实验证实,DNMTi或HDACi抑制剂联合IFN-α处理肝癌细胞能显著促进细胞的凋亡。通过使用裸鼠荷瘤和C57小鼠荷瘤模型验证联合治疗的效应,发现DNMTi或HDACi抑制剂联合IFN-α可以促进肿瘤ISGs、ERVs和CTAs的表达,增强瘤体的免疫原性,招募和活化更多的杀伤性免疫细胞亚群到瘤体位置,增强干扰素的治疗效应。同时在RIG-IKO/WT的小鼠荷瘤模型中,我们发现RIG-I的缺失会增加抑制剂处理后肿瘤细胞的成瘤体积,说明了肿瘤细胞的免疫原性的增加与RIG-I识别通路的激活相关,而且能够降低肿瘤细胞的干细胞性。接下去我们将进一步研究DNMTi或HDACi抑制剂增加干扰素效果的特异性和机制,明确联合治疗的效应。第二部分 染色质重塑复合体SWI/SNF亚基BAF180对干扰素效应的调控作用与机制研究表观遗传调控中基因的染色质重塑在肿瘤的发生中发挥了非常重要的作用。本部分的研究关注了 SWI/SNF复合体的一个亚基BAF180在炎症与肿瘤中的调控作用。以往研究表明,在肾透明细胞癌中BAF180的突变通过影响DNA修复和基因组的稳定性影响肿瘤的发生。但是,在对肿瘤进行免疫治疗的情况下,BAF180的突变会增加肿瘤细胞自身炎症通路的激活,能够招募包括CD8+T细胞在内更多的免疫细胞到肿瘤部位发挥作用。以上研究说明BAF180对肿瘤及炎症应答有调控作用。本研究中,我们首先在多种炎症模型中验证BAF180对炎症因子产生的调控功能。我们发现,在使用IFN-α刺激巨噬细胞和MEF细胞后,BAF180能够负向调控VSV病毒感染引起的炎症二次应答。抑制BAF180表达后,这两种细胞在IFN-α刺激后诱导的炎症应答耐受被打破,炎症因子IL-6以及ISG15的表达升高。我们也发现抑制BAF180表达后STAT和Caspase信号通路的活化显著增强,证实了 BAF180的负向调控功能。然后,我们进一步探索了其机制,通过ChIP实验,我们发现,BAF180表达降低时,炎症因子IL-6以及ISG15的启动子区域的H3K27me3的甲基化修饰会增加。一般情况下,H3K27me3甲基化修饰的增加会降低对应基因的表达。但是在IFN-α刺激细胞后,炎症基因的甲基化修饰会降低,产生炎症耐受。然而,H3K27me3的增加能使炎症基因启动子区域的甲基化修饰接近细胞的初始状态,降低了免疫耐受产生的可能。为了进一步证实我们的设想,我们使用BAF180抗体进行了免疫共沉淀实验,发现在干扰素的作用下,BAF180能够与H3K27me3的甲基化修饰发生结合。这说明,BAF180很可能与组蛋白甲基化转移酶上的甲基结合,减少了组蛋白上的H3K27me3的修饰,也有可能通过与染色质上的H3K27me3甲基化修饰结合,在空间上阻止了第一次炎症反应后期,组蛋白甲基化转移酶在附近位点增加H3K27me3修饰的途径。从而维持了干扰素使用后,炎症基因启动子区域的H3K27me3低水平修饰,使细胞的炎症应答能够处于耐受的状态。我们进一步在肝癌细胞系HepG2中验证了 BAF180能够负向调控包括ERVs和CTAs等免疫原性基因的表达,以及与基因TSS区域H3K27me3甲基化修饰相关的作用机制。在之后的课题研究中,我们会探索干扰素信号是如何调控靶向炎症基因区域的特异性,进一步通过结构解析等方式研究其中的分子机制,为肿瘤治疗的联合用药提供可能。