研究背景和目的先天性心脏病(congenital heart disease，CHD，先心病)，是胚胎时期胎儿的心脏血管系统发育异常所引起的心脏和血管在形态、结构、功能、代谢上出现异常，其中法洛四联症（Tetralogy of Fallot，TOF）是最常见的紫绀型CHD，占所有CHD的6.8％，严重危害婴幼儿健康。与心脏发育相关的基因发生改变是导致CHD发生的常见原因。心脏发育过程在不同时间和空间上涉及各种转录因子的调控和多种基因精确表达，表达异常会导致各种CHD的发生。应用转基因和基因敲除等技术发现，NK型同源盒基因转录因子2.5（NK2transcription factor related，locus5，Nkx2.5）和Lim同源盒基因转录因子1（Insulin Gene Enhancer Binding Protein1，ISLet1或ISL-1）是调控第一和第二生心区心肌前体细胞分化发育的重要转录因子，大量研究表明Nkx2.5和ISLet1基因突变可引发TOF的出现与发生。亚甲基四氢叶酸还原酶（Methylenetetrahydrofolate Reductase，MTHFR）与叶酸和甲硫氨酸代谢有关，是二者代谢通路的的关键酶。研究表明人类MTHFR基因发生突变引起该酶活性降低，可导致CHD的发生。本课题对中国汉族人群207例TOF患者Nkx2.5、ISLet1、MTHFR基因全部外显子进行筛查，以求发现变异位点，并研究探讨新变异位点与TOF发生的关系和作用机制。方法血液样本来源于2009年1月～2012年12月沈阳军区总医院先心病内科住院确诊的TOF患者207例，其中男118例，女89例，年龄2.58±1.39岁。所有病人经临床症状结合X片、心电图、超声心动图、心血管造影检查证实TOF诊断，均排除高血压、肝、肾、肿瘤、糖尿病、神经系统等其他疾病。对照组213例，其中男性136例，女性77例，年龄2.87±1.67，该组人群经X片、心电图、超声心动图检查排除先心病，并排除高血压、肝、肾、肿瘤、糖尿病、神经系统等其他疾病。采用试剂盒法抽提血液基因组DNA，用巢式聚合酶链反应-单链构象多态性分析（Nested polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism，PCR-SSCP）对207例TOF患者Nkx2.5、ISLet1和MTHFR基因全部外显子进行检测。对新发现的ISLet1基因E137K变异位点，用测序法证实其存在，并对先证者家系进行了调查研究。对发现的MTHFR基因c.1333C>T证实其为单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP），并对其进行聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性（PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism，PCR-RFLP）分析，运用统计学方法分析该SNP位点与先心病发病风险之间的关系。结果1.经巢式PCR-SSCP对NKx2.5、ISLet1和MTHFR基因基因全部外显子的检测，结合测序法，我们发现中国TOF患者ISLet1基因中存在国内外均未见报道的E137K变异位点，并发现了MTHFR基因c.1333C>T变异位点。2.由SSCP发现并经反复测序证实了ISLet1基因Exon3中存在E137K新位点的改变，经基因序列分析表明，该位点在全序列中位置为G9557A，位于外显子3中，cDNA位置为G648A，由于碱基改变而导致氨基酸由谷氨酸（Glu）转变为赖氨酸（Lys）（E137K），氨基酸由酸性氨基酸变为碱性氨基酸，并由弱亲水性变成亲水性较强的氨基酸。此变异位点参与编码的氨基酸具有高度同源性和保守性，位于编码蛋白第二个LIM结构域中。3. ISLet1基因E137K家系调查中发现了国内外均未见报道的Nkx2.5基因外显子2中G3456T变异位点。位于外显子2的3′UTR区中，该位点所在位置具有高度保守性和同源性，此变异位点所在区域有可能是hsa-miR-1225-3P microRNA作用的目标靶。4.家系调查结果：家系调查7人，先证者本人、外祖父和母亲同时存在ISLet1和Nkx2.5基因两个新变异位点的改变。三人ISLet1基因均存在外显子3cDNAG648A新位点G/A杂合子改变，其他家系成员在该位点则为GG野生型改变，家系中基因分布频率GA型发生率为42.9%（7例中有3例），GG型为57.1%（7例中有4例），未发现AA型；对于Nkx2.5基因外显子2中G3456T位点改变，先证者本人为TT突变型，母亲和外祖父均为G/T杂合子改变，其他家系成员该位点为GG野生型，家系中GT型发生率为28.6%（7例中有2例），GG型占57.1%（7例中有4例），TT型占14.3%（7例中有1例）。5. MTHFR基因c.1333C>T变异位点经序列分析，该位点位于外显子8中，由于碱基改变而导致氨基酸由精氨酸（Arg）转变为色氨酸（Trp）（A445T）。6.针对MTHFR基因c.1333C>T变异位点，采用PCR-RFLP方法进行消化分割为三种基因型：CC型，CT型和TT型。先心病组等位基因频率（C，66.18%；T，33.82%）与对照组（C，73.00%；T，27.00%；χ2=4.6207，p=0.0316）明显不同。先心病组基因型频率（CC，47.34%；CT，37.68%；TT，14.98%）与对照组（CC，52.11%；CT，41.79%；TT，6.10%；χ2=8.8129，p=0.0122）不一致。该位点基因多态性与先心病患病风险之间的关系统计分析数据表明纯合子基因变异比较（TT对CC：OR=2.70，95%CI1.34–5.45，χ2=8.04，p=0.005）在统计学上与先心病发病风险有关系。而杂合子比较(CT对CC：OR=0.99，95%CI0.66–1.49，χ2<0.01，p=0.972)在先心病的发病风险上没有明显意义。结论1.首次在中国TOF人群中发现ISLet1基因E137K、Nkx2.5基因G3456T和MTHFR基因C1333T变异位点的存在。2. ISLet1基因E137K变异位点基因分布频率中分布最多的为GG型，其次为AG型，分布最少的为AA型，具有家族发生倾向性的基因型为AG型和GG型。但其与CHD的关系尚需研究，可能由于氨基酸改变导致LIM第2结构域的结构功能发生了改变，进而影响了与LIM同源域的结合，并影响与其他蛋白协同调控的作用。此外由于E137K变异位点的改变，影响了ISLet1基因的表达，进一步影响Mef2C等心脏发育基因网络相关基因的表达，导致CHD或TOF发生的危险性，其功能改变有待于进一步研究证实。3. G3456T变异位点基因分布频率中GG型分布最广，GT型次之，TT型最少，GT型及TT型的发生具有家族倾向性。推测其功能可能是变异位点所在区域为hsa-miR-1225-3P作用的目标靶，因此抑制Nkx2.5基因的翻译。当该位点碱基发生改变后，影响hsa-miR-1225-3P microRNA与该区域的结合，导致Nkx2.5表达异常，同时影响心脏发育基因网络中其他基因的表达，从而导致或增加TOF或其他CHD发生的危险性。4. MTHFR基因c.1333C>T变异位点基因多态性与先心病患病风险之间的关系统计分析数据表明纯合子基因变异在统计学上与先心病发病风险有关系，而杂合子在先心病发病风险上没有明显意义。