研究背景和目的:　　 严重脓毒症导致的多器官功能障碍仍然是临床上严重创伤、烧伤患者的主要死亡原因，深入理解脓毒症患者发病过程中的病理生理机制是寻找脓毒症有效治疗策略的关键手段。有资料证实，脓毒症后期免疫功能紊乱是临床脓毒症患者死亡的关键诱因之一，其免疫功能障碍包括辅助性T细胞(Th)1型反应向Th2型反应“漂移”、巨噬细胞表达的主要组织相容性复合物Ⅱ(MHC)及共刺激分子表达的丧失、淋巴细胞和树突状细胞的大量凋亡等，而淋巴细胞的过度凋亡在其中占有重要地位。　　 调节性T细胞(regulatory T cells，Treg)是一类具有免疫负调控功能的成熟T细胞亚群，对免疫耐受和免疫平衡的维持发挥着关键作用，在脓毒症免疫功能紊乱中的作用也受到了越来越多的关注。Treg表现为免疫无能性和免疫抑制性两大特性，主要通过细胞接触依赖机制和细胞因子分泌的方式发挥免疫抑制效应。脓毒症发病的过程中，Treg发挥着一个关键“调控点”的作用，通过诱导效应性T细胞(Teff)的凋亡、下调树突状细胞表面共刺激分子表达、抑制CD4+/CD8+T淋巴细胞功能、介导Th1向Th2反应的漂移等不同的机制发挥免疫抑制效应。　　 Treg诱导Teff凋亡的机制研究已有多篇报道，可能包括抑制CD4+CD25-Teff细胞白细胞介素(IL)-2 mRNA的表达、竞争性消耗IL-2(细胞因子剥夺的方式)以诱导CD4+CD25-Teff的凋亡、通过Fas配体(FasL)/Fas途径诱导CD4+CD25-Teff细胞凋亡、经由颗粒酶依赖机制促进CD4+CD25-Teff的凋亡等，但其确切分子调控机制并不清楚，尚待进一步探讨。转化生长因子β1(transforming growth factor,TGFβ1)是Treg分泌的一种多功能免疫效应因子，包括可溶性及膜结合型(TGFβ1m+)。有资料证实，Treg能够通过TGFβ1m+以接触依赖的方式抑制CD4+CD25-Teff增殖，我们推测，TGFβ1m+可能参与了Treg介导Teff凋亡的信号转导过程。　　 TGFβ1的信号主要通过其下游的Smad分子传递，在TGFβ信号通路中，活化的TGFβ1首先结合Ⅱ型TGFβ受体(TβRⅡ)，随后与Ⅰ型TGFβ受体(TβRⅠ)二聚体形成活化的信号复合物，TβRⅡ激酶区引起TβRⅠ-GS结构域磷酸化并活化。活化的TβRⅠ与胞浆内以同源寡聚体存在的Smad2/3分子短暂结合，使Smad2/3分子C端的SSxS基序中两个丝氨酸残基磷酸化而激活，并与Smad4结合形成异源六聚体进入胞核，作为转录因子单独或与其他DNA结合蛋白共同激活特定靶基因的转录。　　 Bcl-2家族蛋白是一组与线虫抗凋亡基因CED-9同源的蛋白质，对T淋巴细胞的凋亡具有精细调控作用。Bcl-2家族分为促凋亡成员(Bax、Bak、Bim、Bmf、Bad、Bid)和抗凋亡成员(Bcl-2、Bcl-w、Bcl-xL、Mcl-1、Bfl-1/A1)。正常情况下，促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白结合处于失活状态，在凋亡信号的刺激下，作为凋亡感受器的Bim蛋白感受到凋亡信号的刺激后释放作为凋亡执行者的Bax、Bak蛋白，Bax、Bak蛋白则结合到线粒体外膜上，促进线粒体外膜通透性增高，即线粒体外膜上的巨型通道开放，导致线粒体外膜的透化作用(MOMP)、膜两面的离子分布失衡，膜电位下降、细胞色素C释放、胱天蛋白酶(caspase)9激活，造成细胞凋亡。　　 Caspase家族成员是一组与凋亡密切相关的蛋白酶，在凋亡的调节中起着核心作用。caspase的活化包括外源性途径和内源性途径，外源性途径由死亡受体信号(TNF-受体家族)始动，通过形成死亡诱导信号复合物(DISC)介导caspase8的激活;内源性途径由应激信号(如TGFβ)始动，受到Bcl-2家族的促凋亡和抗凋亡蛋白的调节，通过细胞色素C的释放激活caspase9。最终活化的caspase8、caspase9都通过激活下游的caspase3介导细胞的凋亡。鉴于此，我们拟观察脓毒症状态下小鼠脾脏Treg的表型及比例的变化以及CD4+CD25-Teff中凋亡信号通路的活化情况，初步探讨Treg通过TGFβ1m+促进CD4+CD25-Teff的凋亡的分子机制，旨在从新的角度探寻调控脓毒症中Teff过度凋亡的新靶点。　　 实验方法:　　 1.模型制备及实验分组:应用SPF级健康雄性BALB/c小鼠复制盲肠结扎穿孔(CLP)造成脓毒症模型。小鼠随机分为正常对照组、假伤组(sham组)、CLP组、CLP+PC61组、CLP+HRPN组，其中PC61为Treg的特异性抑制剂，HRPN为PC61的同型对照蛋白IgG。上述各组中每组动物各20只，CLP+PC61组、CLP+HRPN组先于CLP术前5天腹腔注射PC61及HRPN后再建立脓毒症小鼠模型。Sham组只游离盲肠，不行盲肠结扎和穿孔术。　　 2.各组小鼠CLP术后24 h眼球取血，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测外周血中细胞因子IL-2、IL-4、IL-10、干扰素(IFN)-γ、TGFβ含量变化。　　 3.采用免疫磁珠法分离纯化小鼠脾脏CD4+CD25+Treg细胞及CD4+CD25-Teff细胞，流式细胞术检测各组小鼠CD4+CD25+Treg细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)、叉头翼状螺旋转录因子p3(Foxp3)、TGFβ1m+的表达以及CD25比例的变化，聚合酶链反应(PCR)检测Treg中TGFβ1 mRNA的变化;流式细胞术检测各组小鼠CD4+CD25-T的凋亡率，并通过统计学软件进行Treg TGFβ1m+表达率和Teff细胞凋亡率的相关性分析。　　 4.采用Western blot检测各组小鼠CD4+CD25-T内Smad2/Smad3、磷酸化(P)-Smad2/P-Smad3以及Bcl-2家族蛋白Bcl-2/Bim的表达;流式细胞术检测各组小鼠CD4+CD25-T内线粒体膜电位改变情况;共聚焦显微镜检测细胞色素C的变化;化学比色法检测各组小鼠CD4+CD25-Teff内caspase3、caspase8、caspase9的活化情况。　　 5.统计学方法:采用SPSS13.0统计学软件进行统计学分析，计量资料用(x)±s表示，组间均数比较采用单因素方差分析，P＜0.05代表差异有统计学意义。　　 主要结果:　　 1.术后CLP组小鼠出现一系列符合脓毒症症状的表现，死亡均发生在术后12h之后，72 h死亡率50％，初步建立了稳定的脓毒症小鼠模型;造模后24 h呈现细胞免疫功能障碍改变。　　 2.术后24 h CLP组小鼠外周血中促炎细胞因子包括IL-2、IFN-γ水平均较正常对照组和sham组显著升高(P＜0.01)。CLP+PC61组IL-2、IFN-γ水平升高更加明显，与CLP组比较存在明显差异(P＜0.01)。抗炎细胞因子IL-4、IL-10、TGFβ在CLP组与正常对照组和sham组比较，仅IL-4水平呈明显升高(P＜0.01)，而IL-10、TGFβ升高不明显。CLP+PC61组IL-4、IL-10、TGFβ水平较CLP组呈现不同程度的下降(P＜0.05或P＜0.01)。　　 3.小鼠脾脏单个核细胞经过MACS两次分选后，经流式细胞仪检测CD4+CD25+Treg纯度可达到95％，CD4+CD25-Teff纯度可达90％，所获得的Treg和Teff细胞经台盼蓝检测活性均达95％以上。　　 4.Treg的特异性表型Foxp3及CTLA-4的表达在正常对照组和sham组均无明显差异，而在CLP组则明显升高(P＜0.05或P＜0.01)。CLP+PC61组Foxp3及CTLA-4表达恢复至正常对照组水平，与CLP组存在明显差异(P＜0.05或P＜0.01)。TGFβ1m+水平在CLP组亦明显升高，而PC61处理组则显著下降，甚至低于正常对照组和sham组(P＜0.05)。CD25在CD4+T细胞中的比例变化趋势与TGFβ1m+变化一致，在CLP+PC61组低于正常对照组和sham组(P＜0.05)。　　 5.正常对照组和sham组TGFβ1 mRNA表达量无统计学差异，CLP组与正常对照组和sham组比较其表达量明显增强(P＜0.01)，而CLP+PC61组TGFβ1mRNA表达量显著低于正常对照组、sham组和CLP组(P＜0.01)。　　 6.各组Teff的凋亡率在CLP组最高，达23.98％，CLP+HRPN组凋亡率为21.74％，与CLP组无统计学差异(P＞0.05)。而CLP+PC61组Teff凋亡率与正常对照组和sham组无统计学差异，但明显低于CLP组(P＜0.01)。通过统计学分析发现，Treg细胞TGFβ1m+表达率与Teff细胞凋亡率呈显著正相关(Pearson相关系数r=0.791，p=0.000)。　　 7.各组CD4+CD25-Teff内Smad2/Smad3表达均无明显差异，CLP组P-smad2/P-Smad3表达量明显高于正常对照组和sham组(P＜0.01)，CLP+PC61组P-smad2/P-Smad3表达与正常对照组和sham组无明显差异，但显著低于CLP组(P＜0.01)。CLP组CD4+CD25-Teff内抗凋亡蛋白Bcl-2的表达与正常对照组和sham组比较明显降低(P＜0.01)，促凋亡蛋白Bim的表达则显著升高(P＜0.01)。而CLP+PC61组的抗凋亡蛋白Bcl-2的表达与正常对照组和sham组比较亦明显降低(P＜0.01)，但显著高于CLP组(P＜0.01); CLP+PC61组促凋亡蛋白Bim的表达与正常对照组和sham组比较明显升高(P＜0.01)，但仍然明显低于CLP组(P＜0.01)。与正常对照组和sham组比较，CLP组CD4+CD25-Teff内线粒体膜电位显著下降(P＜0.01)，PC61干预组与正常对照组、sham组比较均无统计学差异，但明显高于CLP组(P＜0.01)。细胞色素C的变化趋势与线粒体膜电位相反，CLP组细胞色素C水平明显高于正常对照组、sham组(P＜0.01)，而CLP+PC61组细胞色素C水平与对照组、sham组比较无显著差异，但明显低于CLP组。　　 8.CLP组CD4+CD25-Teff中caspase3、caspase8、caspase9活性较正常对照组和sham组均明显升高(P＜0.01)，而给予PC61处理组CD4+CD25-Teff内caspase3、caspase9活性与正常对照组和sham组比较无统计学差异，但显著低于CLP组(P＜0.01);虽然caspase8活性明显高于正常对照组和sham组，但仍低于CLP组(P＜0.01)。　　 主要结论:　　 1.应用CLP方法建立的脓毒症小鼠模型稳定、可靠，能够满足标准化动物模型的要求，为进一步实验研究奠定了良好基础。　　 2.采用免疫磁珠法分离获取小鼠脾脏Treg细胞，所得细胞纯度高，细胞活力好，完全可以满足进一步实验的要求。　　 3.脓毒症小鼠脾脏Treg免疫抑制活性增强，促进CD4+CD25-Teff发生凋亡，该作用可能为TGFβ1m+所介导。推测其大致过程为Treg上的TGFβ1m+通过与Teff上表达的TGFβ受体结合，激活下游的Smad2/Smad3信号分子，Smad2/Smad3转移到细胞核内调节Bcl-2家族基因的表达，通过增加促凋亡Bim蛋白的表达，降低抗凋亡的Bcl-2蛋白的表达，促进作为凋亡执行者的Bax、Bak蛋白与线粒体外膜结合，导致线粒体外膜通透性升高、膜电位降低，进而促进细胞色素C的释放，细胞色素C通过与Apaf-1的结合激活caspase9，活化的caspase9再通过激活caspase3最终导致了Teff的凋亡。