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目的:结核性脑膜炎(tuberculous meningitis,TBM),约占肺外结核的7-10% [1],是由结核杆菌引起的中枢神经系统感染性疾病,致残率和致死率较高,其预后与早期诊断及时治疗密切相关。但结脑的诊断,尤其是早期诊断比较困难,因为结脑患者的脑脊液(CSF)中结核杆菌的数量很少,脑脊液涂片抗酸染色阳性率很低约为10%,而结核菌培养所需时间(4～8周)较长,且阳性率仅20～30%[2],对临床早期诊断价值有限。相关性研究表明结核抗原存在可以作为结核菌存在的证据[3],因而检测脑脊液(cerebrospinal fluid CSF)中的结核抗原对TBM的诊断很有价值。免疫组化法检测脑脊液单核细胞内结核菌素纯蛋白衍生物(protein purified derivative, PPD)实验,对临床诊断TBM具有一定的参考价值,但此抗原尚有一些不足之处。PPD为成分不明确的复合抗原(多克隆),存在一定的假阴性和假阳性,因此寻找一种独特的抗原对TBM的诊断非常必要。早期分泌性抗原靶6 (6Kd early secretory antigenic target ,ESAT-6)为结核分枝杆菌感染早期所分泌的蛋白,具有高度的分布特异性和良好的免疫原性,当结核杆菌在感染的单核巨噬细胞内生长时, ESAT-6抗原表达量明显提高,因此采用单克隆抗体(免疫组化法)检测脑脊液单核细胞内ESAT-6可能会增加诊断结脑的敏感性和特异性。本课题研究的目的是将ESAT-6与PPD对结核性脑膜炎的诊断价值进行比较,为结核性脑膜炎的诊断提供有效的方法。方法:将2009年1月～2009年7月神经内科住院的40例病人分为两组,一组为结脑组:入选标准参考Ahuja[3]的临床诊断标准,共20例,男8例,女12例,年龄2-59岁,中位值年龄24.5岁,其中单纯结脑16例,合并颅外结核者4例。另一组为对照组:共20例,男9例,女11例,年龄1-59岁,中位值年龄26岁。根据第五版神经病学诊断标准入选,其中化脓性脑膜炎5例,新型隐球菌脑膜炎2例,病毒性脑膜炎8例,脑囊虫病1例,脑肿瘤2例(听神经瘤1例,肺癌脑转移1例),脊髓炎1例,布氏杆菌病1例。对所有患者均进行脑脊液常规、生化、细胞学检查(MGG染色)和阿利新兰染色。取脑脊液1ml,用Therm-4 Shandon Cytospin型玻片离心机(购自英国)离心玻片3张,用免疫组化的方法检测单核细胞内的PPD和ESAT-6抗原。将沉淀有细胞的玻片放入中性甲醛中固定10分钟,然后用蒸馏水冲洗,0.01MPBS浸泡5分钟,3%H2O2去离子水孵育10分钟,以消除内源性过氧化物酶活性。滴加封闭用山羊血清工作液室温孵育15分钟倾去。一张玻片滴加适当比例稀释的单克隆鼠抗人ESAT-6抗体(购自美国ADL公司),另一张滴加兔抗结核分枝杆菌多克隆抗体(购自美国Abcom公司),以PBS缓冲液代替一抗为阴性对照。4℃冰箱孵育过夜。PBS冲洗3次每次3分钟。滴加生物素化二抗(购自中杉金桥公司)工作液室温孵育15分钟,PBS冲洗3次,每次3分钟,滴加辣根酶标记的链酶卵白素工作液, 37℃孵育15分钟,PBS冲洗3次每次3分钟,显色剂显色(DAB)5分钟,流水冲洗10分钟。苏木素染色3分钟,自来水冲洗浮色。光学显微镜(OLYMPUS-BX41日本)下观察,脑脊液图文分析仪(MCDS-2020重庆)采图判读结果,单核细胞胞浆呈棕色为阳性结果,单核细胞胞浆无色为阴性结果。结果1临床资料:结脑组患者发热及意识障碍发生率分别为100%, 65%,对照组为70%, 25%,两组之间差异显著,而头痛、恶心呕吐、颅高压、脑膜刺激征、脑局灶体征、脑电图两组无明显差别。2脑脊液常规、生化:结脑组白细胞数3～14000个/mm3,平均为952.5±3086个/mm3,糖0.8～4.1 mmol/L,平均为1.76±0.735mmol/L;蛋白含量0.61～2.39 g/L,平均为1.35±0.53/L;氯化物96～122.4 mmol/L,平均为110.9±8.46mmol/L;对照组细胞数0～2980个/mm3,平均为352±717.02个/mm3;糖0.09～4.7 mmol/L,平均为2.866±1.089 mmol /L;蛋白0.08±4.95 g /L,平均为0.973±1.356 g /L,氯化物由106～142.0 mmol/L,平均为120.96±9.45 mmol/L。结脑组较对照组糖和氯化物明显降低,而白细胞数和蛋白无明显差别。3细胞学表现:结脑组脑脊液细胞学20例全部为混合细胞反应,均未见肿瘤细胞且阿利新兰染色阴性。对照组中混杂细胞学9例,淋巴样细胞反应5例,正常细胞学反应2例,激活单核细胞样细胞学反应2例,中性粒细胞反应2例,隐球菌脑膜炎者细胞学及阿利新兰染色均找到隐球菌。脑囊虫病嗜酸性粒细胞明显增多。肿瘤患者找到肿瘤细胞且激活单核细胞增多。在动态观察中显示结脑病人随治疗好转中性粒细胞逐渐减少,但持续较长时间,同时激活的淋巴细胞、单核细胞逐渐增加,浆细胞出现,这与结脑动态变化相符。4单核细胞内ESAT-6抗原:可在脑脊液中检测到单核细胞内的ESAT-6,大多数单核细胞都有较强的胞浆染色,且多次检测可持续阳性,激活单核细胞较少染色或染色较浅。20例TBM患者中14例ESAT-6抗原阳性,6例阴性,对照组中仅1例病毒性脑膜炎患者阳性,此方法诊断TBM敏感性为70%,特异性为95%,约登指数0.65。在20例TBM病人中,最早发病5天,最晚发病120天可检测出胞内ESAT-6。5单核细胞内PPD抗原: 20例TBM患者中13例PPD抗原阳性,7例阴性,对照组中2例病毒性脑膜炎患者阳性,18例阴性。此方法诊断TBM敏感性为65%,特异性为90%,约登指数0.55。6 ESAT-6及PPD诊断TBM比较:敏感性P>0.05,特异性P>0.05,二者之间敏感性和特异性均无统计学差异。结论1结脑患者临床表现较重,常伴有发热及意识障碍。结脑患者临床表现复杂多样与其他神经系统疾病较难鉴别。2脑脊液生化可为结脑诊断提供一定依据,但脑脊液常规意义较小。3脑脊液细胞学对结脑的诊断和鉴别诊断具有重要参考价值。4结脑患者脑脊液单核细胞内存在ESAT-6抗原。TBM组与对照组比较ESAT-6阳性率差异显著,说明该方法对诊断和鉴别诊断TBM方面有意义。5检测单核细胞内单克隆ESAT-6抗原与检测单核细胞内多克隆PPD抗原相比其敏感性、特异性无显著差别,可能是病例数少所致。但ESAT-6抗原的约登指数高于PPD抗原的检测,两种方法的优劣有待于扩大病例数进一步比较。