猪伪狂犬病( Pseudorabies , PR)是由猪伪狂犬病病毒( Pseudorabies virus, PRV)引起的一种高度接触性、急性传染病。我国自1947年首次报道该病以来,随着养猪业集约化规模化的发展,已有20多个省市报道发生了该病,并在许多种猪场呈暴发流行趋势,给我国养猪业造成了巨大的经济损失。因此,建立有效的诊断检测方法对控制和消灭PR具有重要的意义。本研究分离鉴定猪伪狂犬病病毒(JS株)并探索了猪体内病毒核酸的分布规律;利用大肠杆菌表达系统表达了PRV gD和gE蛋白;研制出针对PRV的单克隆抗体。1、猪PRV JS株的分离鉴定及感染猪体内病毒核酸的分布规律用PRV特异性的引物对江苏某猪场疑似猪伪狂犬病的病死仔猪组织病料进行PCR鉴定,可扩增到特异性的条带。以病料接种PK-15细胞,24小时即出现细胞病变,PCR法和病毒分离试验均证明所分离病毒为PRV。PRV分离株接种兔后出现奇痒症状并麻痹致死,接种仔猪后出现持续发热,肌肉震颤等症状,因此该分离株为强毒株,命名为JSZ。对自然感染发病猪脏器进行PCR检测,病毒在仔猪体内广泛分布,其中脾脏的检出率最高,可达100 %;对人工感染猪的直肠和鼻腔棉拭样品进行PCR检测,病猪排毒最长可达13天。PRV JSZ的分离鉴定为病原学研究提供了生物材料,病毒核酸排毒规律研究为病毒抗原的检测提供依据。2、PRV gD、gE基因的克隆及原核表达参照Genbank发表的PRV gD和gE基因序列,分别设计两对引物,通过PCR方法扩增出PRV糖蛋白gD的668 bp基因片段和PRV糖蛋白gE基因去信号肽后的主要抗原区域558 bp基因片段,克隆至pET-32a的T7启动子的下游,分别命名为pET-32a-D和pET-32a-E,在IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳发现,pET-32a-D和pET-32a-E均在大肠杆菌中得到了高效表达,重组蛋白条带大小分别为45 kDa和43 kDa。PRV gD、gE蛋白的表达为建立PRV抗体检测方法提供了基础材料。3、PRV单克隆抗体的制备以PK-15细胞增殖PRV,将收获的病毒用蔗糖密度梯度超速离心法进行纯化,将纯化后的抗原免疫BALB/C小鼠,取免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合。用间接ELISA方法筛选阳性克隆,并采用有限稀释法对其进行亚克隆,共获得6株能稳定分泌抗PRV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2F5、2G10、3H10、4D11、6B4、6D5。单抗2F5亚类为IgG,其余均属于IgM。所有单抗具有良好的特异性,与PPV、PRRSV、PCV2、HCV无交叉反应。这些单抗的成功研制为进一步建立敏感性高、特异性强、简便快速诊断PRV抗原的方法打下了基础。