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化脓隐秘杆菌(Trueperella pyogenes,T.pyogenes)是普遍存在于牛、羊、猪及其他重要经济动物黏膜上的一种条件性致病菌。T.pyogenes可在家畜间广泛传播,并导致多种皮肤、内脏器官及关节的非特异性化脓性感染。T.pyogenes溶血素蛋白(Pyolysin,PLO)是T.pyogenes分泌的唯一一种溶血素,也是T.pyogenes首要的毒力因子。目前分离的所有T.pyogenes菌株中都可以检测到PLO的表达。本研究首先利用重组蛋白PLO(recombinant PLO,rPLO)制备了不同动物抗rPLO多克隆抗体,并检测了五段位于PLO第1-3结构域(PLO D123)中截短蛋白rPLO 1-110、rPLO95-156、rPLO 141-204、rPLO 190-296以及rPLO 281-393与不同动物抗rPLO多克隆抗体的免疫反应性。Western-blot结果表明,兔抗rPLO多抗只能与rPLO 1-110及rPLO 190-296发生特异性反应,鼠抗rPLO多抗可以与rPLO 1-110、rPLO 95-156及rPLO 190-296发生特异性反应,而鸡抗rPLO多抗则可以与除rPLO 281-393之外的四个截短片段反应。rPLO281-393没有与任何一种动物的抗rPLO多克隆抗体发生特异性反应,因此我们认为这是一段免疫非显性区域。由于上述三种动物抗rPLO多克隆抗体均可以与rPLO 1-110及rPLO 190-296反应。因此,为进一步确定位于PLO 1-110及PLO 190-296中的抗原决定簇,本研究利用兔抗rPLO多抗在PLO D123中筛选出了其所针对的B细胞线性表位Trx-EP1(rPLO 20-33)和Trx-EP2(rPLO 249-260)。并发现鸡抗rPLO多抗和鼠抗rPLO多抗均可以与Trx-EP1及Trx-EP2有重叠部分的四段相邻截短肽反应。这说明EP1和EP2两个表位所在区域为免疫显性区,并可能暴露于PLO分子外侧。另外,本研究制备了不同动物抗EP1和EP2表位肽多克隆抗体,并对其进行抗溶血活性分析,发现鼠抗Trx-EP2多抗可以中和rPLO引起的溶血,而鸡抗Trx-EP2却不能。这说明利用不同动物制备的针对同一抗原表位的抗体与抗原表位结合的方式可能并不相同。在上述工作的基础上,将PLO第4结构域(PLO D4)编码核酸与PLO D123中的两个抗原优势区编码核酸相融合,制备重组抗原蛋白rPLO 1-110-D4以及rPLO 190-296-D4。分别将红细胞膜作为疫苗佐剂或使用弗氏佐剂与重组蛋白混合,免疫实验动物。攻毒实验结果表明,将rPLO 1-110-D4及rPLO 190-296-D4作为疫苗抗原免疫小鼠可以使小鼠对T.pyogenes攻击产生一定的抵抗能力。综上所述,本研究确定了PLO D123中的抗原优势区并在此基础上构建了重组抗原。攻毒保护实验表明,用重组抗原制备的疫苗免疫小鼠,能够延长细菌攻击后小鼠的存活时间,提高小鼠的存活率,为动物提供针对T.pyogenes感染的不完全免疫保护。本研究为PLO的结构及功能研究提供了新依据,同时也为T.pyogenes新型疫苗的研究提供了新思路。