植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）是胃肠道中发现的广泛存在于发酵食品中的革兰氏阳性乳酸菌（lactic acid bacteria,LAB）。与LAB的许多其他菌株一样,它通常作为益生菌应用于食品工业中。在本研究中,将Red重组系统介导的dsDNA重组和RecT蛋白介导的ssDNA重组分别结合CRISPR/Cas9系统开发了植物乳杆菌WCFS1无痕基因组编辑方法,包括基因敲除,插入和点突变,同时发现甲基化酶（Dam）显着改善ssDNA重组效率。该方法应用于植物乳杆菌WCFS1生产GlcNAc的代谢工程。敲除编码葡糖胺-6-磷酸（GlcN-6P）异构酶/脱氨酶的nagB基因以减少F6P到GlcN6P的逆反应,引入了内源强启动子3a替换预测的glmS核糖开关用以过表达GlmS1以及GlmS1中的点突变以减轻反馈抑制。通过优化发酵条件,得到的菌株能够产生797.3 mg/LGlcNAc而不引入任何外源基因和质粒。其中,以植物乳杆菌WCFS1中原噬菌体重组酶介导的基因组工程,即Gam,Beta和Exo的潜在类似物Lp0640,Lp0641和Lp0642介导的双链重组为基础,引入CRISPR/Cas9系统作为筛选工具,开发出无痕基因组敲除方法。野生菌的基因组在重组酶的作用下与dsDNA发生重组而改变,重组成功的菌株能够在CRISPR/Cas9系统的筛选下存活。引入CRISPR/Cas9系统而不使用loxP/Cre系统和抗生素,既避免在基因组上引入外源DNA同时减少实验时间。基因插入较难实现,故开发双步法,首先利用抗生素作为筛选条件实现基因插入,留下的loxP位点利用CRISPR/Cas9辅助的敲除方法敲除。双链重组在点突变方面效果欠佳,故尝试引入RecT介导的单链重组结合CRISPR/Cas9系统。利用pSIP411质粒表达植物乳杆菌WCFS1 内源RecT,通过单链重组实现基因组单个氨基酸的点突变同时改变临近PAM位点,使改造菌株能够在CRISPR/Cas9系统存在条件下存活。设计点突变位点时,为避免错配修复而设计五个连续碱基错配,导致单链重组使用范围有限,尝试引入甲基化酶（Dam）提高单链重组整体效率的同时,实现三个碱基的连续错配达到五个碱基连续错配相同的效率进而实现基因组任意单个氨基酸的突变,极大的扩展了点突变的适用范围。我们选择改造N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）合成途径来验证我们无痕基因组编辑方法的有效性。GlcNAc是糖胺聚糖的前体,其在维持软骨健康及关节组织功能中起重要作用。因此,它被广泛用作治疗骨关节炎的食品补充剂。通过发酵生产GlcNAc在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中有一定技术积累。我们利用开发的无痕基因组编辑方法敲除植物乳杆菌WCFS1中编码葡糖胺-6-磷酸（GlcN-6P）异构酶/脱氨酶的nagB基因和起调控GlcN-6P产量的glmS核酶,该核酶抑制GlcN-6P的积累而导致GlcNAc产量降低。另外在glmS1基因前插入内源强启动子3a（P3a）提高关键酶GlmS1的表达量。最后对GlmS1蛋白的G472位置进行点突变,突变为丝氨酸,解除该酶的负反馈抑制。将以上基因组改造菌株命名为WG3,发酵生产GlcNAc达456 mg/L。生产GlcNAc时会消耗丙酮酸生成乙酰辅酶A导致NADH积累,过量NADH积累破坏代谢平衡。植物乳杆菌WCFS1在发酵时添加血红素和甲基萘醌能够激活呼吸链而消耗NADH,通过这种方式平衡NADH改善菌株生长状态进而提高产量,该工程菌株在优化发酵条件的情况下能够生产797.3 mg/L GlcNAc。