【研究背景】截止到2010年，英国、美国、中国大陆以及阿拉伯国家的糖尿病（Diabetesmellitus, DM）患病率分别已经达到7%、11%、15%、和17%。而75%-80%的糖尿病患者死于心血管意外，提示心血管并发症是糖尿病患者的“头号杀手”。随着对动脉粥样硬化发病机制的深入理解及血管再通治疗的广泛开展，糖尿病冠状动脉大血管病变的治疗已取得阶段性进展，但令人意外的是，糖尿病患者心血管意外的发生及死亡率仍居高不下。目前国际公认心脏微循环功能障碍是糖尿病缺血性心脏病结构、功能损害的重要表现和因素之一。大量研究证明，以VEGF及其受体为代表的血管生成相关因子具有同时促进通透性上调和血管新生的功能，但无法全面解释糖尿病缺血性心脏病微血管病变的发生发展过程。而笔者在攻读硕士期间的研究结果(硕士毕业论文题目“早期糖尿病大鼠心肌微血管的病理变化及与VEGF和PKC-β的关系”)也同样提示在调控糖尿病心脏微血管病变的病理生理过程中，仍有未明确的因素与机制。S1P是一种具有生物活性的鞘酯类物质，已有研究证明血管内皮细胞表达其受体亚型S1P1和S1P3不仅参与体内VEGF调控的多种病理生理过程，而且具有独立于VEGF之外的血管调节作用，强烈提示其参与糖尿病心脏微血管病理生理调节的可能性。但是，S1P1/3相关的下游分子错综复杂(Erk，Rac， PKC等)，具体是哪些分子可能参与介导调控糖尿病心脏微血管损伤仍然未知。而PKC家族作为细胞内经典信号通路上的关键分子，介导多种包括心脏保护在内的病理生理过程。而笔者硕士期间的研究基础也证明其亚型PKCβⅡ在糖尿病缺血性心脏病微血管损伤与保护中发挥着重要的作用。那么，是否PKCβⅡ就是介导S1P1/3调控心脏微血管病理生理功能，进而影响糖尿病缺血性心脏病的关键分子，也有待于进一步验证。【研究目的】1.明确S1P1/3在糖尿病心脏微血管损伤调节中的重要作用和相关机制，并阐明S1P受体激动剂FTY720对糖尿病心脏微血管的保护作用；2.明确S1P1/3在糖尿病心脏微血管缺血/再灌注损伤中的重要作用和相关机制，并阐明S1P受体激动剂FTY720后处理对心脏微血管缺血/再灌注损伤的保护作用。【研究方案】1.实验1（基于研究目的1）：1.1动物实验部分(每组10只)1) STZ(50mg/kg)一次性腹腔注射制备糖尿病大鼠模型，并根据实验分组需要，在病程4w时每天给予或不给予一次FTY720(1mg/kg)腹腔注射进行干预，所有动物在病程8w时取用；2)动物实验分组：正常组(Con)，糖尿病组(DM)，空载干预组(DM+Ve)，FTY720治疗组(DM+FTY720)；3)通过免疫荧光技术对Tunel/CD31/DAPI进行多重标记，激光共聚焦显微镜下观察心脏组织中血管内皮细胞的数量和凋亡情况；4)通过血管铸型技术，扫描电镜下观察心脏微血管生成情况；5)利用硝酸镧作为示踪剂，透射电镜下观察心脏微血管屏障功能；6)通过免疫荧光技术对不同分组大鼠心脏组织中S1P1、S1P3的表达水平进行初步观察7)借助激光捕获显微切割系统，采取心脏微血管样品，用于下一步分子生物学检测；8)通过RT-PCR检测心脏微血管组织中S1P1、S1P3和PKCβⅡ的mRNA表达水平。1.2细胞实验部分（所有实验重复3次）1)培养并鉴定大鼠心脏微血管内皮细胞，根据分组需要给予正常或高糖培养(25mm/L)，同样根据分组需要给予或不给予FTY720干预(10nmol/L)和PKCβⅡ过表达；2)细胞实验分组：正常培养组(Con)，高糖培养组(HG)，空载干预组(HG+Ve)，FTY720治疗组(HG+FTY720)，PKCβⅡ过表达组(HG+FTY720+PKCβⅡ)；3)采用Tunel/DAPI免疫荧光双标技术，对心脏微血管内皮细胞凋亡情况进行检测分析；4)通过Transwell小室对细胞迁移进行检测；5)通过In vitro vascular permeability assay kit进行单层心脏微血管内皮细胞通透性检测；6)通过Subcellular Protein Fractionation Kit for Cultured Cells对细胞核与细胞膜进行分离，用于下一步分子生物学检测；7)通过Western blot检测心脏微血管内皮细胞中S1P1、S1P3和PKCβⅡ的蛋白表达情况。2.实验2（基于研究目的2）：2.1动物实验部分(每组10只)1) STZ(50mg/kg)一次性腹腔注射制备糖尿病大鼠模型，并根据实验分组需要，在病程8w时给予或不给予心脏缺血/再灌注手术(30min/3h)；同样根据实验分组，在再灌注前10分钟给予或不给予FTY720(1mg/kg)，再灌注3小时后采取所需动物标本；2)动物实验分组：糖尿病组(DM)，糖尿病+假手术组(DM+Sham)，糖尿病+缺血/再灌注手术组(DM+I/R)，空载干预组(DM+I/R+Ve)，FTY720治疗组(DM+I/R+FTY720)；3)通过大鼠模型右侧颈动脉实施逆行插管至左心室,实时记录血流动力学参数并分析；4)通过免疫荧光技术对Tunel/CD31/DAPI进行多重标记，激光共聚焦显微镜下观察心脏组织中内皮细胞的数量和凋亡情况；5)利用硝酸镧作为示踪剂，透射电镜下观察心脏微血管屏障功能；6)通过硫黄素S (Thioflavin-S)/伊文氏蓝双重染色评估心脏微血管闭塞情况7)借助激光捕获显微切割系统，采取心脏微血管样品，用于分子生物学检测；8)通过RT-PCR检测心脏微血管组织中S1P1、S1P3和PKCβⅡ的mRNA表达情况。2.2细胞实验部分（所有实验重复3次）1)高糖培养基(25mm/L)培养大鼠心脏微血管内皮细胞，根据分组需要给予或不给予和PKCβⅡ过表达；同样根据分组需要进行或不进行模拟缺血/再灌注(30min/3h)处理，以及在再灌注前给予或不给予FTY720干预(10nmol/L)；2)细胞实验分组：高糖培养组(HG)，高糖+模拟假手术组(HG+Sham)，高糖+模拟缺血/再灌注组(HG+SI/R)空载干预组(HG+SI/R+Ve)，FTY720治疗组(HG+SI/R+FTY720)，PKCβⅡ过表达组(HG+SI/R+FTY720+PKCβⅡ)；3)采用Tunel/DAPI免疫荧光双标技术，对心脏微血管内皮细胞凋亡情况进行检测分析；4)通过In vitro vascular permeability assay kit进行单层心脏微血管内皮细胞通透性检测；5)通过Subcellular Protein Fractionation Kit for Cultured Cells对细胞核与细胞膜进行分离，用于下一步分子生物学检测；6)通过Western blot检测心脏微血管内皮细胞中S1P1、S1P3和PKCβⅡ的蛋白表达情况。【研究结果】1.实验1（基于研究方案1）：1.1动物实验部分：1)以多次随机血糖≥16.7mmol/L作为糖尿病模型成功的标志，本实验糖尿病大鼠模型构建成功率在90%以上；2) Tunel/CD31/DAPI多重标记的免疫荧光结果显示，糖尿病心脏组织中血管内皮细胞数量减少，但是凋亡指数显著增高；而FTY720可以明显减少凋亡；3)血管铸型结合扫描电镜的结果显示，糖尿病心脏组织中出现数目繁多排列紊乱的心脏微血管；FTY720可以明显缓解上述病理性血管新生的情况；4)硝酸镧结合透射电镜的实验结果显示，糖尿病会导致心脏微血管通透性上升，屏障功能减弱；FTY720可以改善上述病理现象；5)免疫荧光结果初步显示与正常大鼠相比，糖尿病大鼠心脏组织中S1P1表达下降，S1P3表达上升；FTY720干预可以上调S1P1并下调S1P3的表达；6) RT-PCR结果显示与正常组相比，糖尿病心脏微血管中S1P1表达下降，S1P3和PKCβⅡ表达增高；FTY720干预可以上调S1P1并下调S1P3和PKCβⅡ的表达水平。1.2细胞实验部分1)低密度乙酰脂蛋白荧光染色的阳性结果可以确认本实验大鼠心脏微血管内皮细胞培养成功； Western结果同样可以确定实验所涉及PKCβⅡ过表达稳定；2)与正常组比较，高糖培养基中心脏微血管细胞凋亡指数明显上升，FTY720可以显著减少凋亡，但对于PKCβⅡ过表达组，FTY720减少细胞凋亡的作用显著减弱；3)与正常组相比，高糖培养基中心脏微血管内皮细胞迁移能力下降，FTY720可以部分恢复高糖诱导的细胞迁移能力下降，但在PKCβⅡ过表达组中，FTY720的作用显著减弱；4)高糖培养基中单层心脏微血管内皮细胞的通透性明显高于正常组，FTY720可以缓解高糖诱导通透性上升的趋势，但PKCβⅡ过表达组中，上述FTY720缓解通透性上升的作用被显著抑制；5) Western blot结果显示与正常组相比，高糖诱导心脏微血管内皮细胞中S1P1表达下降，细胞膜S1P3表达上升，而细胞核S1P3表达减少，同时伴有PKCβⅡ表达上升；FTY720干预可以缓解上述变化；但PKCβⅡ过表达对细胞中S1P1和S1P3未产生显著影响。2.实验2（基于研究方案2）：2.1动物实验部分：1)与糖尿病组相比，缺血/再灌注损伤会进一步减弱大鼠心室收缩/舒张功能；缺血后给予FTY720可以明显减少缺血/再灌注引起的心室功能损伤；2) Tunel/CD31/DAPI多重标记的免疫荧光结果显示，糖尿病+缺血/再灌注手术组中心脏血管内皮细胞数量急剧减少，凋亡指数显著增高；FTY720治疗组中凋亡明显减少；3)通过在透射电镜下对示踪剂硝酸镧的观测，缺血/再灌注会在糖尿病基础上进一步损害心脏微血管的屏障功能，导致通透性上升；FTY720的缺血后干预可以部分恢复屏障功能；4)糖尿病+缺血/再灌注手术组中心脏微血管闭塞面积明显大于糖尿病组以及假手术组， FTY720治疗组中心脏微血管闭塞面积显著减少；5) RT-PCR检测心脏微血管组织中S1P1、S1P3和PKCβⅡ表达情况显示，与糖尿病组和糖尿病+假手术组相比，糖尿病+缺血/再灌注手术组S1P1表达下降，S1P3表达增加，PKCβⅡ表达增加；FTY720治疗可以明显缓解上述蛋白的表达变化。2.2细胞实验部分1) Western结果可以确定实验所涉及PKCβⅡ过表达稳定；2) Tunel/DAPI免疫荧光双标结果显示，与高糖培养组比较，高糖+模拟缺血/再灌注组中心脏微血管细胞凋亡指数明显上升，FTY720可以显著减少凋亡，但对于PKCβⅡ过表达组，FTY720减少细胞凋亡的作用显著减弱；3)与高糖培养组相比，模拟缺血/再灌注可以显著上调单层心脏微血管内皮细胞的通透性，而FTY720可以缓解上述诱导通透性上升的趋势，但PKCβⅡ过表达组中，FTY720作用被显著减弱；4)心脏微血管内皮细胞中S1P1、S1P3和PKCβⅡWestern blot结果显示，与高糖培养组相比，高糖+模拟缺血/再灌注组中S1P1表达下降，细胞膜S1P3表达增加而细胞核S1P3表达下降，同时伴有PKCβⅡ表达增高；加入FTY720干预后，上述蛋白的表达变化显著缓解；但是PKCβⅡ表达过表达组中，S1P1和S1P3表达情况与FTY720治疗组无明显区别。【结论】1. S1P1和S1P3的变化与糖尿病心脏微血管损伤密切相关；FTY720通过上调S1P1，激活S1P3的核膜转位,可以改善病理性血管新生情况和心脏微血管屏障功能的下降；而上述生物作用的实现至少部分依赖其下游的PKCβⅡ；2. S1P1和S1P3的表达同样与糖尿病心脏缺血/再灌注损伤紧密相关；FTY720可以通过调节S1P1的表达和S1P3的核膜转位，激活下游的PKCβⅡ,减少心脏血管内皮细胞的凋亡，上调心脏微血管通透性，减少心脏微血管的闭塞面积，进而改善糖尿病大鼠的心功能。