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背景与目的结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是最常见的恶性肿瘤之一,在我国常见恶性肿瘤中其死亡率位列第五。2015年国家卫生计生委医政医管局、中华医学会肿瘤学分会制订的《中国结直肠癌诊疗规范》指出,我国2011年结直肠癌的发病率和死亡率分别为23.03/10万和11.11/10万。结直肠癌的发生发展是一个涉及多因素、多步骤的复杂过程。流行病学和肿瘤分子生物学表明氧化应激(oxidative stress, OS)、炎症与结直肠癌之间密切相关。氧化应激与炎症反应产生或释放的氧自由基、炎性细胞因子和趋化因子可诱导DNA损伤、细胞增生和血管生成而促发肿瘤。细胞膜三磷酸腺苷结合转运蛋白超家族成员G2 (ATP-binding cassette family G2, ABCG2)是一种由655个氨基酸残基组成的跨膜糖蛋白,其编码基因位于人类染色4q22,属ABC基因家族。目前关于结直肠癌中ABCG2的研究主要涉及其作为药物转运子与化疗耐药机制的关系,至于其它方面作用了解甚少。本课题组前期体外研究首次发现ABCG2具有保护结直肠细胞免受活性氧(reactive oxygen species, ROS)诱导的氧化应激损伤作用,该效应可能与ABCG2抑制细胞核因子-κB (nuclear factor kappa B,NF-κB)信号通路及抑制相关炎症因子表达有关。在此基础上,本研究进一步观察了人结直肠癌裸鼠模型中ABCG2表达变化对体内组织氧化应激指标及炎症因子水平的影响,为结直肠癌靶向治疗提供新靶点和理论依据。实验方法1、常规培养LoVo.HCT-116、HT-29三种人结肠癌细胞株。采用免疫印迹法(Western blot)检测不同细胞株中ABCG2蛋白表达情况。从中选择较高表达ABCG2的人结肠癌细胞作为后续研究对象。2、采用shRNA慢病毒干扰系统抑制所选细胞株癌细胞内ABCCG2的表达(shABCG2组细胞),同时设立仅转染病毒载体的阴性对照组(shcont组细胞)。利用荧光显微镜观察病毒感染效率,采用Western blot检测两组细胞中ABCG2蛋白水平,验证ABCG2沉默效果。选择合适的病毒感染复数(multiplicity of infection, MOI)及感染时间进行后续研究。3、采用不同浓度(0、0.5、1.0mM;)H2O2处理两组细胞4 h,用超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)检测试剂盒和总谷胱甘肽(total glutathione)检测试剂盒,分别测定两组细胞内SOD、总谷胱甘肽含量(GSH+GSSG)及谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase, GR)活力；同时采用流式细胞术检测两组细胞凋亡状况。4、将shABCG2组细胞或shcont组细胞分别注入裸鼠皮下,建立人结直肠癌小鼠模型(分别为shABCG2组小鼠与shcont组小鼠)。5、采用免疫荧光检测法测定两组小鼠移植瘤新鲜组织标本中ROS水平变化。6、采用总谷胱甘肽检测试剂盒测定两组小鼠移植瘤新鲜组织标本中总谷胱甘肽及GRJ水平。7、采用酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA)检测两组小鼠移植瘤新鲜组织中白介素8(interleukin-8, IL-8)与肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)、血清中白介素-6(interleukin-6, IL-6)水平;采用实时定量聚合酶链式反应(real time RT-PCR)检测两组小鼠移植瘤新鲜癌组织标本中IL-8、生长调节致癌基因p(growthregulated oncogene-β, GRO-β) mRNA水平。8、采用Western blot及免疫组化法检测两组小鼠移植瘤新鲜组织中IκB-β和磷酸化IκB-β (phospho-IκB, p-IλB-α)表达状况。实验结果1、三株人结直肠癌细胞中ABCG2蛋白存在不同程度的表达,以HT-29细胞株ABCG2表达相对较高,故选择HT-29进行后续实验。2、荧光显微镜检测可见细胞转染病毒效率达90%以上,Western blot结果显示shABCG2组细胞中ABCG2蛋白表达水平明显低于shcont组细胞,表明ABCG2-shRNA慢病毒转染能有效地抑制5hABCG2组细胞内ABCG2表达,同时确定MOI值为20,转染时间为24h。3、与H2O2(0mM)未处理比较,0.5 mM或1.0mMH2O2处理两组细胞4h后,细胞内SOD与总谷胱甘肽水平均降低；而与shcont组细胞比较,0.5 mM或1.0mMH2O2处理shABCG2组细胞后SOD与总谷胱甘肽含量降低更明显。同时,随着H202处理浓度增加,两组细胞凋亡数也增多,但shABCG2组细胞凋亡程度均低于shcont组细胞。4、与shcont组小鼠比较,shABCG2组小鼠移植瘤组织中ROS含量明显增加。5、与shcont组小鼠比较,shABCG2组小鼠移植瘤组织中总谷胱甘肽含量和GR活力下降。6、与shcont组小鼠比较,shABCG2组小鼠移植瘤组织中IL-8、TNF-α水平明显增高,血清中IL-6含量明显增高。7、与shcont组小鼠比较,shABCG2组小鼠移植瘤组织中IL-8 mRNA水平未见变化,(GRO-β mRNA水平明显增高。8、与shcont组小鼠比较,shABCG2组小鼠移植瘤组织中IκB-β表达下降,β-IκB蛋白表达上升。结论1、ABCG2可降低HT-29结直肠癌细胞及其裸鼠移植瘤组织中的氧化应激水平；2、ABCG2可抑制HT-29结直肠癌细胞及其裸鼠移植瘤组织与血清中相关炎症因子水平；3、ABCG2可抑制HT-29结直肠癌细胞裸鼠移植瘤组织中NF-κB信号通路；4、ABCG2可促进HT-29结直肠癌细胞凋亡。