一、嗜水气单胞菌诱导的草鱼肠道炎症实验模型的构建目的:嗜水气单胞菌是引起养殖鱼类肠道炎症的主要条件致病菌,其致病机理很大程度上仍不清楚。本研究旨在构建嗜水气单胞菌诱导的草鱼肠道炎症模型,为加深了解细菌性肠道炎症的致病机理提供可重复的实验模型。方法:以不同浓度的嗜水气单胞菌菌液经肛门灌肠感染草鱼,根据炎性症状的疾病活动指数筛选出诱导肠道炎症的适宜剂量。以肛门灌注2.7′106 CFU/尾嗜水气单胞菌诱导产生肠道炎症,采用光学显微镜和扫描电镜观察细菌感染后肠道的病理变化,测定整个实验观察期内的肠道组织髓过氧物酶活性,分析促炎细胞因子IL-1b、IL-8和肿瘤坏死因子a(TNF-a)的表达水平的变化。结果:组织病理学检查显示,嗜水气单胞菌感染后第3天,出现肠道绒毛粘连和脱落等严重的肠道损伤,并伴随严重的炎性细胞浸润。超微结构观察也显示,细菌感染引起微绒毛脱落。在随后18天的实验期内,受损的程度绒毛逐渐修复。结果还显示,嗜水气单胞菌感染诱导的炎性应答反应与促炎细胞因子IL-1b、IL-8和TNF-a的表达以及髓过氧物酶的活性密切相关,处理后的第3天,肠道内这些细胞因子的m RNA表达和MPO活性达到最高水平。结论:嗜水气单胞菌引起的肠道损伤以及随后的修复与炎症相关基因或生物标志随时间的变化是完全一致的。因而,我们已成功构建了高密度养殖鱼类肠道炎症的实验模型。该模型可望用于揭示草鱼和其他养殖鱼类细菌性肠炎的致病机制,筛选具潜在应用价值的水产养殖抗菌药物。二、嗜水气单胞菌诱导的草鱼肠炎的肠道转录组比较研究目的:草鱼是一种非模式动物,其基因组信息有限,导致人们对草鱼的分子免疫途径、物质代谢模式及发育机制的了解相对缺乏。本研究旨在利用转录组测序策略揭示肠道组织的基因表达及嗜水气单胞菌诱导后肠道基因表达模式的变化,从而探讨嗜水气单胞菌诱导草鱼肠道炎症的分子机制。方法:分别提取健康草鱼的胸腺、头肾、脾脏、肝脏、表皮、鳃、肠道等组织的总RNA,检测合格后等量混合,构建c DNA文库,利用第二代高通量测序技术进行转录组从头测序。采用嗜水气单胞菌感染草鱼,从感染1 d后具明显炎症症状的草鱼肠道组织中提取总RNA,并以健康鱼肠道组织的总RNA为对照,测定肠道转录组,比较分析细菌诱导后肠道内基因的表达变化。通过GO和KEGG分析,探讨差异表达基因的功能。此外,分别从诱导前以及细菌感染1 d与3 d后的肠道组织提取总RNA,通过q PCR方法检测转录组测序筛选的肠道炎症通路中差异表达基因的时序表达,进而分析炎症相关基因与嗜水气单胞菌诱导的草鱼肠道炎症的关联性。结果:高通量测序共获得45,867,282个总clean reads,装配成120,964个contigs和67,413个unigenes。COG成功注释了23,275个unigenes,分别隶属于25个特定类群。通过GO功能注释,鉴定出26,567个转录本,归于53个功能群,分别属于生物过程、细胞成分与分子功能3个类别。有28,386个unigenes被映射到259个KEGG通路。转录组比较显示,健康对照组和嗜水气单胞菌感染组的肠道中,共表达基因达到18,170个,差异表达的基因达549个,其中,315个上调表达,234个下调表达。按照功能类别,差异表达基因中有36.43%的基因与细胞成份相关,38.25%与基因的分子功能相关,38.99%与参与的生物过程相关。差异基因共涉及到165条通路,主要包括类风湿关节炎、抗原加工和递呈、吞噬体、氧化磷酸化、I型糖尿病、溶酶体、核糖体通路、细胞因子及其受体的相互作用等免疫相关通路。q PCR分析结果显示,嗜水气单胞菌感染后,不同的炎症相关细胞因子在肠道组织中的表达变化存在差异。IL-10、IL-10Ra、IL-10Rb、IL-2RG、IL-17R、IL-22、IL-23等7个基因在致炎1 d后表达量上调至最高水平;IL-12p40、IL12Rb2基因在第3 d上调至最高。IL-23R、IL-6基因则在致炎后第3 d才显著上调,而IL-21在致炎后第3 d显著下调。结论:嗜水气单胞菌感染引起草鱼肠道组织中细胞成分发生变化,细胞因子活性、氧气转运活性、物质跨膜等分子功能失调,细胞有丝分裂、应答细菌感染、免疫应答、ATP的生物合成等生物过程异常,引起肠道炎症通路相关基因显著上调,最终导致草鱼肠道炎症的发生。三、草鱼IL-23p19基因的克隆及其在肠道炎症中的表达特征分析目的:对草鱼IL-23p19进行克隆和分子鉴定的基础上,揭示该基因在肠道炎症过程中的表达特征及其炎症发生中的可能作用。方法:基于转录组测序获得的IL-23p19部分序列设计特异引物,采用c DNA末端快速克隆(RACE)技术从草鱼肠道组织中克隆IL-23p19的全长c DNA,进而分离其基因组DNA。采用生物信息学分析方法解析该基因的结构、编码产物、分子演化。构建重组表达质粒p EGFP-C1-gc IL-23p19,转染HEK293T细胞,揭示草鱼IL-23p19蛋白的亚细胞定位。采用实时定量PCR技术,测定IL-23p19在健康草鱼组织中的表达谱,分析嗜水气单胞菌感染对该基因表达的影响,以及不同感染方式下肠道组织内随时间的表达差异。结果:利用RACE技术成功克隆了草鱼IL-23p19基因(gc IL-23p19)的全长c DNA序列,其ORF长567 bp,编码188个氨基酸。c DNA和基因组DNA序列比对显示,gc IL-23p19由4个外显子和3个内含子组成,其外显子/内含子构成与鲤科鱼类斑马鱼和哺乳动物小鼠和人类的同源基因相同。基于氨基酸序列构建的系统树显示,gc IL-23p19与同属鲤科的鲤鱼、斑马鱼一致性较高而组成一独立分支,该分支而与其他硬骨鱼类聚为一类,而与由鸟类和哺乳动物组成的另一类平行。激光共聚焦分析显示,IL-23p19蛋白主要定位于HEK293T细胞的细胞质中。实时定量PCR分析结果表明,IL-23p19基因在各种组织中均有表达,但组织间的表达水平存在明显差异。其中,头肾、肌肉、肝脏的表达水平最低,而鳃、血液、表皮和体肾的表达最高。腹腔注射嗜水气单胞菌可显著上调IL-23p19表达水平,上调幅度最大的组织是肠道,其他依次为表皮、血液、肌肉、脾脏、鳃等。结果还显示,腹腔注射与肛灌嗜水气单胞菌两种不同的感染方式对肠道IL-23p19表达的调节上存在差异,肛灌24 h后的IL-23p19表达量约达到健康对照的700倍,而腹腔注射仅为70倍。这意味着gc IL-23p19在系统免疫与局部免疫过程中可能存在不同的促炎作用机制。结论:我们首次从养殖鱼类中克隆和鉴定了IL-23p19基因,其表达特征表明该基因在嗜水气单胞菌诱导的草鱼肠道炎症过程中发挥重要的调节作用。四、草鱼IL-23R基因克隆及其在肠道炎症中的功能分析目的:对草鱼白细胞介素-23受体基因IL-23R进行克隆和分子鉴定的基础上,分析该基因在肠道炎症中的功能。方法:基于转录组测序获得的IL-23R部分序列设计特异引物,采用c DNA末端快速克隆(RACE)技术从草鱼肠道组织中克隆IL-23R基因的全长c DNA。对该基因进行分子鉴定的基础上,筛选出IL-23R抗原区并进行抗原区基因合成,构建原核表达载体p GEX5T-IL-23R的重组质粒,以原核表达产物为抗原免疫小鼠,制备多克隆抗体rgc IL-23R p Ab,并经Western blot鉴定其特异性。利用嗜水气单胞菌诱导的草鱼肠道炎症模型进行IL-23R的免疫组化分析。采用q PCR技术定量检测嗜水气单胞菌刺激前后草鱼各组织中IL-23R两个剪接体的表达水平,分析嗜水气单胞菌刺激对不同剪接体表达的影响,比较腹腔注射和肛灌嗜水气单胞菌两种不同感染方式下IL-23R两个剪接体在肠道组织中的表达水平。结果:利用RACE技术克隆了草鱼IL-23R基因的两个剪接体gc IL-23RX1与gc IL-23RX2的全长c DNA,大小分别为2875 bp和2730 bp,分别编码763和717个氨基酸。生物信息学预测显示,两种剪接体均含长22氨基酸残基的信号肽序列,以及一个跨膜结构域。氨基酸序列比对结果显示,与I型细胞因子受体家族保守的WSXWS基序相比,草鱼中相应部位序列为MSEWS,也不同于斑马鱼的CSMWS。系统树分析显示,草鱼IL-23R基因与斑马鱼基因最为相似,相对地与鸟类、爬行类较为接近,而与哺乳类差异较大。SDS-PAGE分析结果显示,原核表达的gc IL-23R抗原区分子量与预测相吻合。Western blot分析证实了多克隆抗体rgc IL-23R p Ab的特异性。肠道免疫组化结果显示,gc IL-23R在肠上皮细胞以及浸润于粘膜组织的嗜酸性粒细胞和巨噬细胞中表达,这与哺乳类观察到的IL-23R表达于T细胞、单核细胞和树突状细胞相类似。q PCR分析显示,IL-23R基因的两个剪接体在各种草鱼组织中均有表达,但总体上gc IL-23RX1的表达水平高于gc IL-23RX2。腹腔注射嗜水气单胞菌后,各种组织中两种剪接体的表达水平出现了不同程度的变化。结果还显示,肛灌对肠道组织gc IL-23RX1和gc IL-23RX2表达的影响明显大于腹腔注射,而且,gc IL-23RX2的表达水平变化幅度大于gc IL-23RX1。结论:我们首次从养殖鱼类中克隆和鉴定了IL-23R基因的两个转录剪接体。IL-23R在嗜水气单胞菌刺激诱导的草鱼肠道粘膜的局部炎症应答中发挥了重要的作用。但是,两种剪接体在草鱼肠道炎症通路中发挥的功能存在差异。