论文部分内容阅读
目的:结直肠癌(Colorectal Cancer,CRC)是严重危害人类健康的消化系统常见恶性肿瘤之一,其发生发展与遗传、生活方式、癌前病变等关系密切。根据2010年统计CRC在全球的恶性肿瘤发病率中男性居第3位,女性居第2位[1],而在我国CRC的发病率也呈逐年上升的态势,且有年轻化、聚居化、地域化等特点,可见CRC已经严重威胁人类的健康与发展。CRC与大多数恶性肿瘤一样,是多基因、多因素、长时间作用的结果。目前,为了提高CRC临床治疗的特异性和敏感性,CRC的发生机制以及相关标志物一直以来是CRC的研究热点,其中非编码RNA特别是微小RNA(micro RNA,miRNA)的发现以及它调控基因表达的研究则为CRC发病机制研究和靶向治疗提供了新的观点和思路。miRNA是一类长度约22个核苷酸的非编码RNA单链结构,广泛存在于动植物体内,可通过与其靶基因的3’端非翻译区(3’Untranslated Region,3’UTR)结合,完成转录后水平的基因调控。每一种miRNA都有能与之特异结合的靶基因,并且调控靶基因的表达,从而影响与靶基因相关的功能。通常一种miRNA可与多种靶基因相结合并调控其功能,多个miRNA也可共同调节同一靶基因的表达[2]。研究显示miRNA可参与人体约3/5的基因调控,包括细胞的生长,分化,增殖,凋亡等[3,4]。近年来随着miRNA成为研究的热点,目前多项研究表明miRNA与各类肿瘤的演进密切相关,根据其作用的不同可以发挥抑癌基因或致癌基因的作用[5],其中miR-133b最早被认为是一种心肌特异性的miRNA,我国胡桂等[6]在2010年研究发现miR-133b在结直肠癌组织及细胞系中表达下调,并与肿瘤的恶性程度有一定的相关性,但其在CRC中的作用机制尚不明确,需进一步探究。miR-204是恶性肿瘤中较常见的异常表达的miRNA之一。miR-204的前体在成熟过程中会加工形成miR-204-3p和miR-204-5p两个单链小分子。现多数研究发现miR-204-5p能显著抑制肿瘤的增殖,且与肿瘤的分级关系密切。但是,miR-204-5p在CRC中的研究报道甚少,其在CRC中的作用机制仍不明确,需进一步探究。本实验的前期实验结果显示(1)miR-133b和miR-204-5p在结直肠癌组织中的表达与癌旁正常组织相比明显下调。(2)miR-133b和miR-204-5p在HT29细胞中表达均高于其它结直肠癌细胞系。(3)通过在线网站(Reg RNA,Mi RBase,miRanda,target Scan)筛选出可能与miR-133b和miR-204-5p结合的靶基因为TGFBR1。本实验在前期研究的基础上(1)通过HT29细胞瞬时转染建立高表达或抑制表达miR-133b,miR-204-5p的结直肠癌细胞系。(2)与对照组的HT29细胞系比较,观察高表达或抑制表达miR-133b,miR-204-5p后对于HT29细胞增殖和周期的影响。(3)通过双荧光酶素报告实验,荧光定量PCR及Western-blot验证前期实验中经筛选得出的可能与miR-133b,miR-204-5p结合的靶基因。方法:(1)利用阳离子脂质体法将miR-133b/204-5p mimics及miRNA-133b/204-5p inhibitors瞬时转染至结直肠癌细胞株HT29中,再利用CCK8和细胞周期检测的方法检测miR-133b,miR-204-5p转染后对结直肠癌细胞在体外的细胞增殖与周期的影响。(2)通过双荧光酶素报告实验,荧光定量PCR及Western-blot验证预实验利用生物信息学在线网站(Reg RNA,Mi RBase,miRanda,target Scan)筛选出可能与miR-133b,miR-204-5p结合的靶基因。(3)采用SPSS16.0对实验所获数据进行统计学分析。CCK8体外增殖实验使用析因设计的方差分析和单因素方差分析;细胞周期检测、双荧光酶素活性检测、荧光定量PCR用两独立样本的t检验,方差不齐时采用近似t检验。P<0.05为差异有统计学意义。结果:(1)成功建立高表达或抑制表达的miR-133b/204-5p结直肠癌细胞系。(2)CCK8法对结直肠癌HT29细胞体外增殖能力检测结果表明与miRNA mimics NC组相比转染miR-133b mimics组和miR-204-5p mimics组细胞增殖能力均减弱(P<0.0001,P<0.001);与miRNA inhibitors NC组相比转染miR-133b inhibitors组和miR-204-5p inhibitors组细胞增殖能力均增强(P<0.001,P<0.001)。(3)流式细胞仪分析细胞周期结果表明与miRNA mimics NC组相比转染miR-133b mimics组G1比例增多,S期细胞比例减少。两组细胞G1期(t=-11.24,P<0.001),S期(t=6.117,P<0.001),与miRNA mimics NC组相比转染miR-204-5p mimics组G1比例增多,S期细胞比例减少。两组细胞G1期(t=-4.03,P<0.05),S期(t=2.855,P<0.05);与miRNA inhibitorscontrol组相比转染miR-133b inhibitors组G1比例减少,S期细胞比例增多。两组细胞G1期(t=4.506,P<0.05),S期(t=-11.66,P<0.001),与miRNA inhibitors NC组相比转染miR-204-5p inhibitors组G1比例减少,S期细胞比例增加。两组细胞G1期(t=4.358,P<0.05),S期(t=-9.76,P<0.001)。(4)双荧光酶素报告实验显示突变质粒MUT-3′UTR与miRNA mimics NC,miR-133b mimics共转染后其荧光素酶活性无差异(P=0.876),突变质粒MUT-3′UTR与miRNA mimics NC,miR-204-5p mimics共转染后其荧光素酶活性无差异(P=0.638);野生型质粒WT-3′UTR与miRNA mimics NC,miR-133b mimics共转染后,荧光酶素活性差异具有统计学意义(P<0.05),野生型质粒WT-3′UTR与miRNA mimics NC,miR-204-5p mimics共转染后荧光酶素活性差异具有统计学意义(P<0.05)。(5)荧光定量PCR结果表明与miRNA mimics NC组相比miR-133b mimics组TGFBR1的m RNA表达量明显降低(t=9.78,P=0.001),与miRNA mimics NC组相比转染miR-204-5p mimics组TGFBR1的m RNA表达量明显降低(t=27.478,P<0.001);与miRNA inhibitors NC组相比miR-133b inhibitors组TGFBR1的m RNA表达量明显升高(t=-7.644,P<0.01),与miRNA inhibitors NC组相比miR-204-5p inhibitors组TGFBR1的m RNA表达量明显升高(t=-17.605,P<0.01)。(6)Western-blot结果表明与miRNA mimics NC组相比miR-133b/204-5p mimics转染后HT29细胞中TGFBR1蛋白水平表达降低,与miRNA inhibitors NC组相比miR-133b/204-5p inhibitors转染后TGFBR1蛋白水平表达增高。结论:(1)增强或抑制结直肠癌细胞中的miR-133b、miR-204-5p表达,能影响HT29细胞的增殖能力和细胞周期。(2)通过双荧光酶素报告实验,荧光定量PCR及Western-blot验证得出TGFBR1是miR-133b和miR-204-5p共同的下游靶基因。