论文部分内容阅读
仔稚鱼消化机能的发育是鱼类消化生理学中的重要研究内容,深入了解仔稚鱼消化系统在结构和功能上的变化对于掌握不同鱼类早期发育阶段的消化特点、营养需要及提高仔稚鱼成活与生长等均有重要意义；目前,有关仔稚鱼消化机能发育研究中所取得的一些成果主要集中海水鱼类。鲤科鱼类占我国淡水鱼类组成的一半以上,是我国淡水养殖鱼类的主要类群。草鱼(Ctenopharyngodon idellus)、鳃(Elopichthys bambusa)和翘嘴鲌(Culter alburnus)是我国内陆水域重要的淡水经济鲤科鱼类,本论文运用形态学、消化酶学、分子克隆及Real-Time PCR等方法,从食性和系统发育角度出发,对上述3种鱼类早期发育阶段其消化道的组织学变化、胰蛋白酶和淀粉酶的mRNA表达及酶活性的变化过程进行了比较研究,并初步探讨了典型的草食性和肉食性的鲤科鱼类消化机能发育的共同模式与食性差异。孵后不同天数(days post hatching, dph)草鱼、鳃和翘嘴鲌的组织学切片结果表明：(1)初孵仔鱼卵黄囊的相对体积以鳃的最大；(2)均在2 dph和3 dph分别出现肠管和口裂,在3 dph、4 dph和2 dph分别出现肠腔；(3)在4 dph、7-9 dph和4 dph其肠腔内分别出现食物团,表明此时草鱼、鳃和翘嘴鲌已分别开始外源性摄食；(4)在5 dph、6 dph和6 dph其肠道内表面分别出现粘膜褶,随后在稚鱼中其粘膜褶的高度和数量不同程度的发育；(5)草鱼和鳃的肠道分别在14 dph和30 dph出现盘曲,而在翘嘴鲌的切片图中未发现其肠道的盘曲；(6)草鱼、鳃和翘嘴鲌的肠道分别于17 dph、30 dph和20 dph分别出现粘液细胞,并在随后其粘膜褶数量逐渐增多。用RACE方法克隆出草鱼、鳃和翘嘴鲌胰蛋白酶原前体基因cDNA全长,其序列分别长869 bp (GenBank accession no. FJ416598)、856 bp(未向GenBank递交序列)和857 bp (GenBank accession no. FJ416597),其中分别包括729 bp、741 bp和744 bp的开放阅读框(ORF), ORFs分别编码242 aa、246 aa和247 aa的胰蛋白酶原前体氨基酸序列。3种鱼类胰蛋白酶原前体氨基酸序列全长均包含维持丝氨酸蛋白酶催化活性和构象所需的保守区域,说明胰蛋白酶原基因克隆的正确性；等电点和进化树分析表明,草鱼胰蛋白酶前体属于硬骨鱼类I型胰蛋白酶原(GroupⅠ),而鳃和翘嘴鲌的胰蛋白酶原这属于Ⅱ型胰蛋白酶原(GroupⅡ)。运用Real-Time PCR和酶活性测定方法,检测了草鱼和翘嘴鲌孵后不同天数胰蛋白酶的mRNA表达及酶活性的变化,结果表明：(1)草鱼和翘嘴鲌胰蛋白酶mRNA均在2 dph得到检测,并在11dph和23 dph出现峰值,从而表现出相似的早期表达模式；(2)2种鱼类的胰蛋白酶比活性均在2 dph得到检测,此时草鱼和翘嘴鲌仔鱼均尚未开口摄食。2种鱼类胰蛋白酶比活性在8 dph均出现主峰值,且分别在20 dph和17 dph出现次峰值；(3)在整个28d的试验期间,草鱼胰蛋白酶比活性显著大于翘嘴鲌的该酶比活性,这可能与其不同食性相关,且这一属性在早期阶段可能业已得到体现。同时,运用RACE克隆出草鱼α-淀粉酶基因的cDNA全长及鳃α-淀粉酶基因的部分cDNA序列。草鱼α-淀粉酶基因cDNA全长1616 bp,其中包含长度为1539 bp的ORF,编码512 aa的α-淀粉酶前体氨基酸序列,该前体序列包括1个15 aa的信号肽；鳃α-淀粉酶基因cDNA部分序列的长度为970 bp,其中包含的长927 bp的ORF编码308 aa的α-淀粉酶氨基酸序列片段,该片段包含了脊椎动物α-淀粉酶催化功能域(β/α)8桶的β4-α4-β5-α5-β6-α6-β7-α7-β8-α8区域。与其它脊椎动物类似,草鱼和鳃的a-淀粉酶的3个保守的催化活性位点残基(Asp, Glu和Asp)均分别位于β4、β5和p7。草鱼和鳃的α-淀粉酶在上述区域及其它的某些氨基酸十分保守,包括3个催化活性位点残基、钙离子结合位点残基和氯离子结合位点残基等。这些α-淀粉酶经典的保守区域确证了草鱼α-淀粉酶cDNA全长和鳃α-淀粉酶cDNA部分序列。多重比对和等电点分析表明,草鱼α-淀粉酶前体的氨基酸组成、等电点及pH7.0时的电荷数等与斑马鱼的较为接近；进化树分析表明,鲤形目草鱼、鳃、斑马鱼和胭脂鱼的α-淀粉酶序列构成一个小的族群。对同属于雅罗鱼亚科的草鱼和鳡的研究表明：(1)在2 dph均检测到草鱼和鳃α-淀粉酶mRNA的表达,但此时鳃的α-淀粉酶mRNA表达水平极低；随着发育,草鱼和鳃均在7 dph表现出最大的α-淀粉酶mRNA表达量,随后下降；在11-30 dph,草鱼a-淀粉酶mRNA的表达缓慢上升且随后持续保持一较高水平,但此阶段鳃α-淀粉酶mRNA的表达持续下降,在30 dph时其其表达量下降到一极低水平；(2)草鱼在3 dph即检测到α-淀粉酶的比活性并在7 dph达到峰值,随后迅速下降,但在9-30 dph期间其α-淀粉酶的比活性逐渐上升；(3)鳡在3 dph无法检测到α-淀粉酶的比活性,直至5 dph才检测到相当于草鱼3 dph的α-淀粉酶的比活性。与草鱼相似,鳡在7 dph其α-淀粉酶的比活性显著上升,但9-11 dph又下降,随后缓慢上升且在16 dph达到峰值。在16 dph后鳡α-淀粉酶的比活性一直下降,直到试验结束。α-淀粉酶的mRNA表达和酶活性结果的初步分析表明,在稚鱼期前后,草鱼α-淀粉酶的持续高表达与鳡α-淀粉酶表达的持续下降可能与这2种鱼类的食性分化紧密相关。