论文部分内容阅读
小麦赤霉病是小麦最常见的病害之一,严重影响小麦产量,甚至危害人畜健康。禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)是小麦赤霉病的主要致病菌种,有效抑制禾谷镰刀菌的生长是防治小麦赤霉病的关键。Surfactin是一种由芽孢杆菌非核糖体合成的环状脂肽,具有优良的表面活性和抗细菌活性,但其抗真菌活性报道较少。本研究具体研究了Surfactin对禾谷镰刀菌菌丝体细胞早、中、晚期等凋亡特征的诱导作用,并进一步解析了其由ROS介导、Metacaspase依赖、MAPK信号通路传导的相关机制。主要研究结果如下:1.Surfactin可诱导禾谷镰刀菌菌丝体发生细胞凋亡。DCFH-DA荧光染色发现,与空白对照组相比,Surfactin处理组呈现绿色荧光的菌丝数明显增加,荧光强度较空白对照组升高6.96倍(p<0.001),提示ROS累积阳性;JC-1荧光染色发现,Surfactin处理组呈现绿色荧光的菌丝数明显增加,绿红荧光比值较空白对照组升高4.89倍(p<0.001),提示线粒体膜电位下降阳性;荧光定量PCR检测发现,Surfactin处理组Metacaspase基因FGSG09204、FGSG12913表达水平分别较空白对照组上调1.43倍和2.07倍(p<0.01);酶活检测发现,Surfactin处理组caspase 9、caspase 3分别较空白对照组升高4.15倍和1.40倍(p<0.001),提示Metacaspase酶活激活阳性;Fluo-3 AM荧光染色发现,Surfactin处理组呈现绿色荧光的菌丝数明显增加,绿色荧光强度较空白对照组升高2.92倍(p<0.001),提示胞内Ca2+过载阳性;Hoechst 33342/PI双染检测发现,Surfactin处理组无呈现红色荧光的菌丝,呈现蓝色荧光的菌丝数明显增加,蓝色荧光强度较空白组升高4.2倍(p<0.001),提示染色质固缩阳性。综上,Surfactin会导致禾谷镰刀菌菌丝体出现胞内ROS累积、线粒体膜电位下降等早期凋亡特征,胞内Ca2+过载、Metacaspase酶激活等中期凋亡特征以及染色质固缩等晚期凋亡特征,表明Surfactin可诱发禾谷镰刀菌菌丝体细胞凋亡。2.Surfactin诱导的禾谷镰刀菌菌丝体细胞凋亡由ROS介导、依赖于Metacaspase激活。NAC(ROS清除剂)预处理可显著降低Surfactin诱发的禾谷镰刀菌菌丝体胞内ROS累积(p<0.001),同时Surfactin所引起的线粒体膜电位下降、Metacaspase酶活升高和染色质固缩等凋亡特征均出现显著减弱或被抑制,提示Surfactin诱导的禾谷镰刀菌菌丝体细胞凋亡由ROS介导。Z-VAD-FMK(Caspase广谱抑制剂)预处理可显著降低Surfactin引起的禾谷镰刀菌菌丝体Metacaspase酶活升高(p<0.001),同时Z-VAD-FMK预处理还可显著减弱或抑制Surfactin所引起的线粒体膜电位下降、ROS累积和染色质固缩等其他凋亡特征,提示Surfactin诱导的禾谷镰刀菌菌丝体细胞凋亡依赖于Metacaspase激活。3.Surfactin诱导的禾谷镰刀菌菌丝体细胞凋亡涉及Mgv1、Gmpk1 MAPK信号通路。荧光定量PCR检测发现,Surfactin处理组禾谷镰刀菌菌丝体Mgv1、Gmpk1基因表达水平显著升高(p<0.001),分别较空白对照组上调6.84倍和1.76倍,Hog1则无显著变化(p>0.05)。添加ERK途径抑制剂可显著抑制Surfactin所引起的禾谷镰刀菌菌丝体Mgv1和Gmpk1基因的表达水平上调,使其表达水平分别下降了55%和32%(p<0.001),添加JNK途径抑制剂和p38途径抑制剂则无显著变化(p>0.05)。同时,添加ERK途径抑制剂和JNK途径抑制剂预处理可显著减弱Surfactin所引起的禾谷镰刀菌菌丝体胞内ROS累积、线粒体膜电位降低、Metacaspase酶活升高等凋亡特征,而p38途径抑制剂无明显效果。表明Surfactin诱导的禾谷镰刀菌菌丝体细胞凋亡涉及Mgv1、Gmpk1 MAPK信号通路。