第一部分超声靶向微泡破坏促进基因转染的实验研究第一章超声辐照对HepG2肿瘤细胞存活率影响的实验研究目的：探讨治疗性超声辐照对HepG2肿瘤细胞存活率的影响,为超声介导基因转染的参数优化提供依据。方法：96孔培养板分成6区(每区4个复孔)种植HepG细胞,置37℃、5%C02培养,细胞贴壁12小时后,室温下(25℃)经培养板底部(探头与培养板底部涂耦合剂充分接触)分别对每区细胞进行治疗性超声辐照。辐照参数采用正交设计方法,根据文献报道的影响因素及常识选定3因素,每因素5水平(声强：0.5 W/cm2,1.0 W/cm2,1.5W/cm2,2.0 W/cm2,2.5 W/cm2；占空比:10%,20%,40%,60%,80%。辐照时间:20s,40s,60s,120s,180s)设计正交表。辐照完成后继续培养24小时后行MTT(噻唑蓝)实验检测细胞存活率,期间光学显微镜观察培养板内的细胞生长状况及形态。结果：超声辐照后,当声强大于2 W/cm2任何情况及声强为1.5 W/cm2、占空比大于60%时,细胞出现明显脱壁、形态变圆、弹坑样聚集以及脱壁细胞内出现颗粒和细胞碎裂等现象,细胞存活率大大降低。超声声强在0.5-1.0 W/cm2,占空比在10%-20%时,细胞存活率达90%以上。统计表明,声强和占空比是影响细胞存活率的主要因素,且声强的影响大于占空比(P<0.05),而辐照时间并非主要影响因素(P>0.05)。结论：治疗性超声的声强和占空比是影响贴壁培养的肿瘤细胞存活率的主要因素,是超声介导基因转染的主要优化参数。第二章超声靶向微泡破坏对HepG2肿瘤细胞生存率影响的实验研究目的：探讨超声靶向微泡破坏(UTMD)对HepG2肿瘤细胞存活率的影响。方法：96孔培养板分成6区(每区4个复孔)种植HepG2细胞,置37℃、5%C02培养,细胞贴壁12小时后,室温下(25℃)经培养板底部(探头与培养板底部涂耦合剂充分接触)分别对每区细胞进行治疗性超声辐照。辐照参数采用正交设计方法,根据初筛实验结果选定选定4因素,每因素4水平设计正交表。超声声强：0.5 W/cm2,0.75 W/cm2,1.0 W/cm2,1.25 W/cm2；占空比：10%,20%,40%,60%；微泡浓度(v/v)：10%,20%,30%,40%；辐照时间：5s,l0s,20s,40s。辐照完成后继续培养24小时后行MTT(噻唑蓝)实验检测细胞存活率,期间光学显微镜观察培养板内的细胞生长状况及形态。结果：超声辐照后,细胞在倒置显微镜下观察,发现声强为0.5-0.75 W/cm2时,其他因素任何所选实验水平,细胞形态均无明显改变；声强为1.0 W/cm2,占空比40%,辐照时间为40秒,微泡浓度30%时,可观察到部分细胞膜内陷现象；声强为1.0 W/cm2,占空比60%,辐照时间为40秒,微泡浓度30%时,可观察到有小片状细胞脱壁现象；声强为1.25 W/cm2,占空比60%,辐照时间40秒,微泡浓度40%时,可观察到脱壁细胞的区域明显变多变大。统计分析发现,在微泡浓度为30%时,声强为1.0 W/cm2或以下,占空比为20%及以下,辐照时间在20秒及以下时,细胞存活率可保持在90%以上(P<0.05)。结论：UTMD处理HepG2中瘤细胞时,微泡浓度为30%(v/v)及以下,声强为1.0 W/cm2或以下,占空比为20%及以下,辐照时间在20秒及以下等条件参数是能确保细胞存活率大于90%的优化参数。第三章超声介导微泡联合聚乙烯亚胺基因转染HepG2细胞的实验研究目的：探讨超声(US)靶向微泡(MB)破坏(UTMD)联合聚乙烯亚胺基因转染HepG2细胞的效果。方法：在前两章研究的基础上,确定超声声强与占空比的参数分别为1.0 W/cm2和20%。通过析因设计,确定微泡浓度和辐照时间2个影响因素,各选4个水平(微泡浓度：10%,20%,30%和40%,辐照时间：10,20,30,40秒)进行实验。采用绿色荧光蛋白(GFP)质粒作为报告基因。HepG2细胞经胰蛋白酶消化收集后,重悬后以106/m1置入12孔培养板,超声辐照从板底辐照悬浮细胞(探头与培养板底部涂耦合剂),辐照后继续常规培养48 h后,流式细胞仪测定GFP转染效率,PI单染后再经流式细胞仪测细胞生存率,筛选出最佳转染参数。再用此优化的参数条件,比较单纯质粒,质粒+US,质粒+MB+US,质粒+PEI,质粒+PEI+US及质粒+PEI+MB+US等6种不同转染方法的基因转染效率与细胞生存率。结果：微泡浓度在30%,辐照时间为20秒时,HepG2细胞具有最大的基因转染效率(39.5%±5.8%),该条件下的细胞存活率达91%±2.7%。在此参数下,单纯质粒(Plasmid),质粒+US,质粒+MB+US,质粒+PEI,质粒+PEI+US及质粒+PEI+MB+US等6种不同转染方法GFP转染效率分别为0.08%±0.01%、1.7%±0.71%、8.36%±3.62%、25.63%±4.84%,29.41%±4.91%,和39.5%±5.8%,统计学分析表明各组间差异有统计学意义(P<0.05),细胞生存率均达到90%以上,差异无统计学意义(P>0.05)。结论：UTMD联合PEI可有效提高HepG2细胞基因转染效率并具有满意的细胞生存率,是有前景的基因靶向转染方法。第四章超声靶向微泡破坏联合聚乙烯亚胺转染siRNA-survivin促进HepG2细胞凋亡的实验研究目的：探讨超声靶向微泡破坏(UTMD)联合PEI基因转染siRNA-survivin对HepG2细胞凋亡的影响。方法：根据RNA干扰设计原则,人工合成2对survivin基因的特异性的寡核苷酸片段,然后将其克隆到siRNA干扰质粒pRNAT-U6.1/Neo,构建针对survivin基因的干扰质粒psiRNA-S-55和psiRNA-S-387,利用UTMD联合PEI基因转染技术,将其转染HepG细胞,并设立空白对照组和阴性质粒对照组,转染48小时后,收集细胞进行RT-PCR半定量检测survivin mRNA水平,western blotting检测survivin蛋白含量,并用流式细胞仪检测siRNA-survivin对HepG2细胞凋亡的影响。结果：siRNA-survivin质粒构建后经测序鉴定表明序列与预先设计的序列完全一致。RT-PCR检测表明psiRNA-S-55组与psiRNA-S-387组survivin mRNA表达水平显著低于空白对照组和阴性对照组(P<0.01),以后者更明显(P<0.05)。Western Blot检测结果表明,psiRNA-S-55组与psiRNA-S-387组的HepG2细胞survivin蛋白表达受到明显抑制(P<0.01),以psiRNA-S-387组抑制作用最强(P<0.05),而空白对照组与阴性对照组差异无统计学意义(P>0.05),各组间内参基因的表达未见明显差别,结果与RT-PCR相符。细胞凋亡检测也表明,psiRNA-S-55与psiRNA-S-387组均检测到肿瘤细胞凋亡,以后者最为明显,差异具有统计学意义(P<0.05),而空白对照组与阴性对照组差异无统计学意义(P>0.05)。结论：运用UTMD联合PEI基因转染方法对HepG2肿瘤细胞进行survivin RNA干扰治疗可有效促进细胞凋亡,是一种有潜力的基因治疗新方法；psiRNA-S387促细胞凋亡作用强于psiRNA-S-55。第五章超声靶向微泡破坏联合聚乙烯亚胺增强小鼠肌肉基因转染的实验研究目的：探讨超声(US)靶向微泡(MB)破坏(UTMD)联合聚乙烯亚胺(PEI)转染对小鼠肌肉基因转染的增强效果。方法：在优化超声辐照的声强与辐照时间参数后,取30只Balb/c小鼠随机分为6组,每组5只(双后肢计共10块胫前肌)。绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA (20μg)按下列分组与SonoVue微泡和／或PEI混合,注入小鼠后肢胫前肌内,然后予以治疗性超声辐照(功率：2 W/cm2,占空比：50％)。A组：PBS组(空白对照组)；B组：质粒+US;C组：质粒+MB+US; D组：质粒+PEI组；E组：质粒+PEI+US组；F组：质粒+PEI+MB+US组。10天后处死小鼠,立即取小鼠双后肢胫前肌冰冻切片,荧光显微镜计数GFP阳性肌纤维数。组织同时送检石腊切片HE染色,光镜观察有无炎性损伤及坏死。结果：A组肌肉组织内未见明显绿色荧光；B组可见绿色荧光表达肌纤维,但GFP阳性纤维数较少,为14±3个；C组GFP阳性纤维个数为58±6个,D组为96±7个,E组为119±11个,F组为158±18个。统计学分析表明,B组GFP阳性的肌纤维数显著低于C组、D组、E组和F组(P<0.01)。以F组的GFP阳性纤维数最多,与其它各组比较均有显著差异(P<0.05)。各组石腊切片未显示明显的炎症反应和坏死。结论：UTMD联合PEI可显著提高小鼠肌肉组织的基因转染效率。第六章超声靶向微泡破坏联合聚乙烯亚胺转染siRN A-survivin治疗裸鼠皮下肿瘤模型的实验研究目的：探讨超声(US)靶向微泡(MB)破坏(UTMD)联合PEI转染siRNA-survivin对HepG2细胞裸鼠皮下移植瘤的基因治疗效果。方法：首先对30只裸鼠皮下种植HepG2肿瘤细胞,选择种植成功的24只荷瘤裸鼠随机分成4组,在肿瘤最大直径为5mm时分别按下述4方案处理。(1)空白对照组,瘤内只注入生理盐水；(2)阴性质粒对照组, UTMD+PEI+质粒psiRNA-N,该质粒不含siRNA基因序列；(3) UTMD+psiRNA-S-387质粒组；(4) UTMD+PEI+质粒psiRNA-S387组。超声仪器为日本伊滕IT0-100超声治疗仪,微泡为Bracco公司的SonoVue。在第1次治疗后每隔3天用药1次,共计6次,每5天测量肿瘤体积一次。在第1次治疗后的第31天小鼠安乐死,取组织送病理检查,同时取组织行RT-PCR检测survivin mRNA含量及western blotting检测survivin蛋白表达水平,并采用Tunel法检测肿瘤细胞凋亡情况。结果：未处理对照组及阴性质粒组肿瘤体积较大,两者比较无统计学差异(P>0.05)。UTMD+psiRNA-S-387质粒转染治疗组与UTMD+PEI+质粒psiRNA-S-387治疗组肿瘤的平均体积均较未处理对照组及阴性质粒组减小,差别均有显著统计学差异。UTMD+PEI+psiRNA-S-387质粒组转染组肿瘤的平均体积最小,与其它各组比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。RT-PCR检测表明UTMD+psiRNA-S-387转染组和UTMD+PEI+psiRNA-S-387转染组的survivin mRNA表达水平与未处理对照组及阴性质粒组比较均有显著降低(P<0.05),以后者最低(P<0.05)。未处理对照组与阴性质粒组无显著差别(P>0.05),western blotting检测与RT-PCR结果一致。凋亡检测表明UTMD+psiRNA-S-387转染组和UTMD+PEI+psiRNA-S-387转染组肿瘤细胞有较大面积的凋亡(P<0.05),后者为最多(P<0.05)。结论：UTMD联合PEI基因转染survivin siRNA可做为HepG2肿瘤基因治疗的一种有效方法,其治疗效果较单用UTMD转染更佳。第二部分超声靶向微泡破坏促进万古霉素治疗表皮葡萄球菌生物膜感染第七章超声靶向微泡破坏对表皮葡萄球菌生物膜形态影响的实验研究目的：探讨超声(US)靶向微泡(MB)破坏(UTMD)作用于细菌生物膜后对其形态结构的影响,为其作为辅助抗生素治疗生物膜相关感染的一种方法提供理论依据。方法：96孔板培养的24小时表皮葡萄球菌生物膜按如下4组进行超声辐照(1)未处理对照组,无US辐照；(2)声强0.5 W/cm2组；(3)声强1.0 W/cm2组；(4)声强1.5W/cm2组；每组均设采用MB和不采用MB 2种条件。各组US占空比均固定为50%,辐照时间均为10 min。辐照完成后生物膜经2%结晶紫染色,用酶标仪在570nm波长处测量紫外吸收光值A570,并在肉眼及光显微镜下进行形态学观察。之后进一步选定3种条件对生物膜进行处理：(1)未处理对照组,(2)单纯US处理组和(3)UTMD处理组。US声强均为0.5 W/cm2,占空比为50%,辐照时间为30min。处理完成后生物膜分别行共聚焦激光扫描显微镜检查和扫描电子显微镜检查。结果：无超声辐照的对照组的无微泡与有微泡组肉眼观察均有一层厚而致密的生物膜,光镜下未见明显微孔。声强0.5 W/cm2时,肉眼观察生物膜与对照组比较无明显差异,但光镜下可见有很少的微孔(约1-10μm)存在。声强1.0 W/cm2时,肉眼可观察到约0.1 mm大小的微孔,应用微泡者孔隙明显增大,约0.5 mm左右,光学显微镜下观察则尤其明显；声强1.5 W/cm2时,则肉眼观察到的微孔更多更大,约0.1-0.5 mm左右,应用微泡者的孔隙也明显增大,有的最大径甚至达到1mm,不用光学显微镜也可观察到。与未处理对照组比较,应用超声或超声联用微泡处理组的生物膜密度有不同程度的降低,并随着声强的增大,生物膜密度下降也最多,差异有统计学意义(P<0.05)同一组内,应用微泡+超声处理者的生物膜密度下降又比单用US处理组又要多(P<0.05)。未处理对照组中,有MB与无MB处理的生物膜密度无明显差别(P>0.05)。激光共聚焦扫描显微镜检查显示超声处理后可见生物膜上微孔存在,均未发现US及UTMD具有直接杀菌作用。扫描电子显微镜观察到单纯US处理组生物膜内细菌可见明显变形,似有皱缩；UTMD处理组的生物膜内细菌表面见许多小凸起,其直径约100nm至几百nm。结论：US及UTMD可导致细菌生物膜上微孔出现,生物膜密度下降,二者不具直接的杀菌作用,但生物膜内的细菌形态发生改变,这些有利于抗生素在生物膜内的穿透而有可能提高其抗菌活性。第八章超声靶向微泡破坏增强万古霉素抗生物膜活性的体外实验研究目的：探讨超声(US)靶向微泡(MB)破坏(UTMD)能否增强万古霉素的活性对抗生物膜,减少生物膜内的存活细菌。方法：96孔板培养的表皮葡萄球菌RP62A (ATCC 35984)12小时生物膜给予下述6组条件处理：(1)未处理对照组,(2)万古霉素处理组,(3)US组,(4)万古霉素+US组,(5)MB+US组,(6)万古霉素+MB+US组。US参数为：声强为1.0 W/cm2,占空比为50%,辐照时间10 min。万古霉素剂量为100μg/ml。采用SonoVue超声造影剂MB,浓度为30%(v/v)。生物膜处理后置37℃温箱内继续培养12 h,结晶紫染色后进行OD570半定量检测,并在肉眼及光学显微镜下对生物膜进行形态学观察。此外,处理后的生物膜用Live/Dead染色进行共聚焦激光扫描显微镜观察,了解生物膜的形态及内部细菌存活情况。处理后的生物膜还分别刮下行CFU计数实验,进一步对生物膜内存活细菌进行定量检测。结果：未处理对照组和万古霉素处理组均形成了一层较厚而致密的生物膜,US组、万古霉素+US组、MB+US组、万古霉素+MB+US组生物膜均可见许多大小不等的微孔,其中MB+US组和万古霉素+MB+US组生物膜微孔显著大于US组及万古霉素+US组,OD57半定量检测也表明US组及万古霉素+US组A570值显著较未处理组和万古霉素处理组低(P<0.01),MB+US组和万古霉素+MB+US组生物膜A570值又显著较US组及万古霉素+US组低(P<0.01)。共聚焦激光扫描显微镜观察进一步证实了生物膜微孔的存在,定量分析软件提示万古霉素+MB+US组较万古霉素处理组及万古霉素+US组有更多的死菌(P<0.01)。CFU计数进一步证实了上述结果。结论：UTMD可有效提高抗生素活性杀灭表皮葡萄球菌生物膜内存活菌,在生物膜相关感染治疗中具有很大的应用前景。第九章超声靶向微泡破坏增强万古霉素抗表皮葡萄球菌生物膜的动物实验研究目的：探讨超声(US)靶向微泡(MB)破坏(UTMD)能否在动物体内具有增强万古霉素治疗表皮葡萄球菌生物膜感染的活性。方法：4只植入体外培养的表皮葡萄球菌RP62A (ATCC 35984)生物膜感染小盘的新西兰白兔分别按以下方案进行处理, (1)未处理对照, (2)万古霉素, (3)万古霉素+US, (4)万古霉素+US+MB。首次处理在生物膜体外感染盘植入24小时后开始,每天3次,每次30 min。US声强为0.5 W/cm2,占空比50%,辐照时间20分钟,在第4组辐照过程中,每5分钟用27G注射器向皮下移植盘区域注射200μL SonoVue,共4次,每区共注入SonoVue为800μL。UTMD处理3天后,兔麻醉后再经耳缘静脉注入空气安乐死,无菌操作条件下取出移植的小盘,在超净台内用灭菌牙签小心刮下生物膜行CFU计数。结果：对照组、万古霉素组、万古霉素+US组和万古霉素+US+MB组的log10CFU分别为5.18±0.25、5.15±0.20、4.68±0.18和3.75±0.19。对照组、万古霉素处理组的log10CFU差别无统计学意义(P>0.05),但万古霉素+US处理组和万古霉素+US+MB处理组的log10CFU与前两组的比较,差异有统计学意义(P<0.05)。万古霉素+US+MB处理组的log10CFU最少(P<0.01)。结论：UTMD可显著提高万古霉素活性治疗新西兰白兔体内的表皮葡萄球菌生物膜感染。