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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的以怀孕母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道症状为特征的一种传染病。PRRSV有两个血清型：欧洲型和北美型。其代表株分别被命名为Lelystad Virus和VR-2332。关于PRRSV病毒基因组RNA的复制、亚基因组mRNA的转录和蛋白的翻译、病毒颗粒组装以及病毒致病机理等许多问题没有解决。尤其是在2006年全国大范围内爆发的“猪高热综合症”之后,作为主要病原的高致病性(High Pathogenicity, HP) PRRSV的致病机理成为了研究热点。PRRSV Nsp10由N端的锌结合结构域(zinc-binding domain, ZBD)和C端的超家族1(superfamilyl, SF1)解螺旋酶(helicase, Hel)区域组成,具有ATP酶(ATPase)和解旋酶活性,在病毒基因组及亚基因组合成过程中起到重要作用。本研究旨在利用北美型和欧洲型PRRSV感染性克隆解析非结构蛋白10(Nsp10)的结构与功能的关系,为进一步剖析病毒遗传组份的结构与功能及其致病机理奠定基础。现将研究内容简述如下：1.利用反向遗传操作解析PRRSV Nsp10ZBD的结构与功能PRRSV Nsp10N端的锌结合结构域(ZBD)主要由多个保守的半胱氨酸(Cys)和组氨酸(His)组成,与Zn2+结合形成锌指结构。为研究ZBD结构与功能的关系,本研究先通过SMART软件预测了Nsp10的锌指结构。接着在感染性克隆的基础上,利用点突变PCR对PRRSV Nsp10ZBD编码的多个氨基酸(特别是保守的Cys和His)进行突变,构建了19个突变克隆,通过DNA转染Marc-145细胞,研究PRRSV Nsp10ZBD结构的改变对病毒基因组的复制、亚基因组的转录以及感染性的影响。结果表明,4个突变体(pMHZM5、pMHH28C、pMHS55P、pMHS55A)拯救出病毒,且突变病毒具有遗传稳定性,其生长过程与亲本病毒相似,但滴度均比亲本病毒低(特别是vMHH28C),且突变病毒形成的空斑比亲本病毒小(vMHS55P除外),说明第28位His被Cys替换后,并不影响锌指结构的形成,但却造成了病毒滴度的降低,第5位精氨酸(Arg)以及第55位丝氨酸(Ser)可能不参与ZBD的功能,从而不影响病毒基因组的复制,后者可能位于铰链区,充当将ZBD与Nsp10剩余部分相连接的作用；其余15个突变体均未拯救出病毒,说明突变的氨基酸影响了锌指结构的形成,从而影响了病毒的感染性,其中突变体pMHH43C被检测到N蛋白的表达,但表达量很低,说明第43位His被Cys替换后并不影响病毒亚基因组的转录过程,推测可能影响了病毒粒子的形成,其余14个突变体均未被检测到N蛋白的表达及亚基因组7的合成,说明保守的Cys和His对病毒基因组的复制及亚基因组的转录至关重要,可能13个保守的Cys和His都参与与Zn2+的结合。本研究还利用真核载体表达亲本PRRSV Nsp10,对一些致死突变体进行反式互补,结果表明这些致死突变体均不能被反式互补,说明利用真核载体表达的亲本PRRSV Nsp10可能无法成为PRRSV复制酶多聚蛋白的一部分,从而不能发挥Nsp10(?)勺功能,推测ZBD在PRRSV Nsp10中可能起到顺式(in cis)调控的功能,对病毒基因组的复制、亚基因组的转录以及病毒粒子包装都极其重要。2.利用反向遗传操作解析PRRSV Nsp10解螺旋酶的结构与功能PRRSV Nsp10解螺旋酶由7个保守的基序(motif)组成,推测这些基序对解螺旋酶的功能起到重要作用。为研究PRRSV Nsp10解螺旋酶结构与功能的关系,本研究利用点突变PCR对欧洲型PRRSV全长感染性克隆Nsp10解螺旋酶基序Ⅰ和Ⅱ编码的多个保守的氨基酸和非保守氨基酸进行突变,构建了一系列突变克隆,通过DNA转染Marc-145细胞,研究PRRSV Nsp10解螺旋酶基序的改变对病毒基因组的复制、亚基因组的转录以及感染性的影响。结果表明,两个突变体(pMHY223F和pMHD225E)拯救出病毒,其生长过程与亲本病毒相似,但滴度均比亲本病毒低,突变病毒vMHY223F形成的空斑形态与亲本病毒相似,但突变病毒vMHD225E形成的空斑比亲本病毒小,说明第223位非保守的极性络氨酸(Tyr)突变成非极性的苯丙氨酸(Phe)以及第225位保守的天冬氨酸(Asp)突变成同为酸性的谷氨酸(Glu)对病毒的复制和转录几乎没有影响；其余突变体(pMHS153A, pMHK155R, pMHE226D)均未拯救出病毒,前者pMHS153A被检测到N蛋白的表达,但表达量很低,说明第153位非保守的丝氨酸(Ser)被丙氨酸(Ala)替换后并不影响病毒亚基因组的转录过程,推测可能影响了病毒粒子的形成；后两者(pMHK155R, pMHE226D)均未被检测到N蛋白的表达及亚基因组7的合成,说明保守的第155位赖氨酸(Lys)和第226位Glu分别对基序Ⅰ和Ⅱ的功能起重要作用,且突变基序Ⅰ和Ⅱ中保守氨基酸对病毒造成的损伤比突变非保守氨基酸大,这也进一步证明了基序Ⅰ和Ⅱ对解螺旋酶功能的重要性；而且这些致死突变体均不能被反式互补,推测解螺旋酶在PRRSV Nsp10中可能起到顺式(in cis)调控的功能,在病毒基因组的复制、亚基因组的转录以及病毒粒子包装过程中扮演着极其重要的角色。3.两型PRRSV Nsp10嵌合克隆的构建两型PRRSV Nsp10的核酸同源性为53.9%,但它们有着相似的ZBD和解螺旋酶,推测它们具有相似的功能。为了研究结构相似的Nsp10是否功能一致,本研究以北美型经典弱毒株感染性克隆(pAPRRS)为主要骨架,利用合适的酶切位点和SOE PCR技术将其Nsp10替换为欧洲型弱毒株感染性克隆(pMSHE) Nsp10,从而构建了两型PRRSV Nsp10嵌合克隆pCHN10.经DNA转染Marc-145田胞后未能拯救出病毒,也未被检测到亚基因组7的合成及N蛋白和Nsp2的表达。结果表明,欧洲型PRRSV Nsp10不能替代北美型PRRS VNsp10,两者可能在功能上有所差异,从而抑制病毒基因组的复制和亚基因组的转录。推测这可能跟两者核酸序列同源性较低有关,欧洲株Nsp10无法成为北美株复制酶多聚蛋白的一部分。这也间接表明了PRRSV Nsp10对基因组的复制和亚基因组的转录起着至关重要的作用。