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[研究目的]TRPS1基因突变导致鼻-指-趾综合征(tricho-rhino-pharyngeal syndrome)其单倍表达不足导致人类骨骼毛发发育异常。研究发现,其编码的蛋白Trps1在肾脏发育过程中起到重要作用。Trps1基因敲除的胚胎小鼠肾脏中肾单位减少,肾脏发育不全。并且,Trps1作用于Bmp7(Bone Morphogenetic Protein7,骨形成蛋白第7因子)下游,介导由Bmp7诱导的间叶-上皮转换(Mesenchymal-to-epithelial transition, MET)。Trps1基因敲除的肾脏间叶细胞不能被Bmp7诱导形成上皮细胞。鉴于Bmp7具有抑制TGF-beta诱导的上皮-间叶转换(Epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)的作用,并能够逆转慢性肾损伤导致的肾脏纤维化。但是作为Bmp7下游转录囚子的Trps1是否参与肾脏上皮细胞向间叶细胞转换,并且其下游作用机制如何尚不清楚。为解决以上问题,我们在前期的实验基础上,从研究Trps1在成年小鼠肾脏的表达入手,设计了TGF-beta-Trps1-靶基因-EMT研究轴线,研究Trps1在TGF-beta诱导的EMT过程中的作用,以及Trps1对下游基因的调控在EMT过程中的作用机制,为深入研究EMT作用机制及探讨抑制／逆转EMT的可能性提供新的理论支持和实验依据。[研究方法]1.通过免疫组化、免疫荧光等手段,标记Trps1蛋白,检测Trps1在成年小鼠肾脏中的表达和分布情况。2.建立单侧输尿管结扎小鼠模型,模拟肾脏纤维化EMT过程,通过检测肾脏纤维化过程中的各项指标,如纤维化程度(Ecad, a-SMA和Coll)及与肾脏纤维化有关的信号传导通路(TGF-beta-pSmad3)明确肾脏纤维化与Trps1表达水平的关系。3.原代培养野生型(WT)及Trps1单倍表达不足(HT)小鼠肾脏近曲小管上皮细胞,通过TGF-beta诱导上皮细胞发生EMT,运用real-time PCR, Western blot,免疫细胞染色等手段,检测Trps1在正常表达及表达不全(haploinsufficiency)的情况下,对上皮细胞发生EMT的影响,找出Trps1作用的下游目的基因,阐明Trps1调控EMT的分子机制。4.运用siRNA (siRNA)干扰Trps1的下游目的基因,通过real-time PCR, Western blot,免疫细胞染色等手段干扰Trps1下游目的基因是否能够抑制/逆转肾脏上皮细胞向间叶细胞转换。[实验结果]1. Trps1特异性表达于小鼠肾脏近曲小管上皮细胞。我们通过免疫组织化学染色方法发现Trps1表达于成年小鼠肾脏皮质。通过与肾小管各个不同节段的分子标的物做对比,我们发现Trps1特异性表达于肾脏近曲小管上皮细胞,其分布范围与近曲小管上皮细胞标的物villin的范围一致。并且,同时标的Trps1和villin的免疫荧光染色显示Trps1和villin共同表达于肾小管上皮细胞,其分布范围完全一致。2. Trps1表达单倍不足(haploinsufficiency)促进单侧输尿管结扎(UUO)导致的肾脏纤维化。UUO导致肾脏间质纤维化,表现为肾小管萎缩以及肾小管间基质沉积。通过HE染色检查结扎过的WT和Trps1HT小鼠肾脏,我们发现病变肾脏均有不同程度的小管扩张,萎缩,间质增多以及间质细胞增生。然而,在Trps1表达单倍不足(HT)情况下,由于UUO导致的间质纤维沉积程度加重。通过免疫组织化学对比发现,Ⅰ型胶原染色程度在HT小鼠UUO肾脏中明显加重(约为WT小鼠UUO1肾脏中Ⅰ型胶原的2倍)。以上结果表明,在Trps1单倍不足加重了由于UUO导致的肾脏纤维化程度。3. Trps1表达单倍不足促进UUO肾脏纤维化过程中的TGF-beta/Smad3信号传导通路。由于TGF-beta信号通路是肾脏纤维化过程中最主要的诱导因素,所以我们检测在Trps1HT小鼠肾脏中纤维化程度加重是否与TGF-beta信号通路有关。对两种基因型小鼠的UUO纤维化肾脏进行real-time PCR和ELISA检测TGF-beta后发现,TGF-beta的mRNA和蛋白水平较阴性对照组均有显著提高。然而,两种基因型间对比发现TGF-beta水平并无显著差异。然后,我们检测了Smad3(在纤维化过程中TGF-beta的主要介导因子)的磷酸化水平(pSmad3)。对pSmad3的免疫组织化学染色发现,pSmad3的表达水平在纤维化肾脏中明显升高,并且在Trps1单倍不足的情况下pSmad3(?)勺水平更高。统计发现,在结扎后的HT肾脏中Smad3的磷酸化水平是WT的2倍以上。4.肾脏纤维化程度与Trps1和Smad7蛋白水平相关。然后,我们在mRNA和蛋白水平检测了纤维化肾脏中Trps1的表达情况,以期探寻Trps1和肾脏纤维化的相关性。经过结扎的肾脏中, Trps1在mRNA和蛋白水平上均较正常肾脏低,表明Trps1表达水平与肾脏纤维化程度呈负相关。另外,我们检测了Smad7在mRNA和蛋白水平上的变化。Smad7是TGF-beta信号传导通路中的重要抑制因子。鉴于在肾脏纤维化过程中Smad2/3的高表达与Smad7水平降低有关,我们检测了在Trps1单倍不足肾脏纤维化过程中出现的Smad3磷酸化水平升高是否与Smad7水平降低有关?检测表明,在HT小鼠正常肾脏中Smad7的基础表达量就比WT小鼠正常肾脏中的Smad7表达量低。而且,在结扎后的HT肾脏中,Smad7蛋白水平继续降低,其降低幅度远高于在WT肾脏中的降低幅度。以上结果说明,Trps1的水平与纤维化程度呈负相关,并且Trps1表达量的降低导致Smad7蛋白水平的下降从而加重了肾脏纤维化的程度。5. Trps1单倍不足促使了TGF-beta诱导的上皮-间叶转换(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT).为了证实Trps1表达量的降低真正影响TGF-beta/Smad3信号通路,我们通过原代培养小鼠肾脏近曲小管上皮细胞(proximal tubule cells, PTCs)来检测在EMT过程中所涉及的各个因子。细胞生物学检测表明,正常和Trps1表达单倍不足小鼠肾脏上皮细胞均表现为上皮细胞特性。然而,经TGF-beta诱导后,Trps1表达单倍不足来源的PTCs (HT-PTCs)中Trps1水平下降程度更大,Smad3磷酸化程度更高,其更易被诱导成为间叶细胞。Real-time PCR和western blot分析发现,经TGF-beta诱导后HT-PTCs中a-SMA的水平是正常PTCS的2-4倍；相反,E-cadherin的表达水平下降到正常PTCs的一半左右。并且,在HT-PTCs中Smad7蛋白的下降程度高。以上结果表明,Trps1单倍不足通过降低Smad7蛋白水平以达到增强TGF-beta/Smad3信号传导通路的目的。6. Trps1单倍不足通过增加Arkadia表达以降低Smad7蛋白水平。进一步研究发现,Smad7水平降低是由于Smad7蛋白降解增加导致。我们检测了Smurf1, Smurf2和Arkadia,三个降解Smad7的E3泛素连接酶。研究发现,在Trps1单倍不足情况下Arkadia表达水平较高,是正常水平的2倍左右。以上结果表明,在EMT过程中Trps1表达降低,导致E3泛素连接酶Arkadia表达上升,从而Smad7降解加剧,最终导致Smad7对TGF-beta/Smad3信号传导通路的抑制作用减弱,TGF-beta诱导上皮-间叶转换的能力增强,纤维化程度加重。7. Arkadia基因干扰能够减轻TGF-beta诱导的EMT。应用Arkadia siRNA干扰Arkadia的表达,我们检测了WT和HT小鼠肾小管上皮细胞经过Arkadia siRNA处理后对TGF-beta的反应情况。经Arkaida siRNA干扰后,WTPTCs及HTPTCs对TGF-beta的反应程度减弱,Smad7蛋白水平恢复到与WTPTCs(?)目同,EMT过程被抑制。以上结果表明,Arkadia siRNA处理能够通过恢复Smad7蛋白水平保护上皮细胞免受TGF-beta诱导,抑制EMT的发生。[结论]Trps1单倍不足通过促进Arkadia对Smad7(?)勺降解过程从而增强了TGF-beta诱导的EMT和间质纤维化程度。意义：该研究通过研究Trps1在肾脏上皮细胞EMT过程中的作用机制阐明了Trps1对TGF-beta/Smad3信号通路的调控作用,为肾脏纤维化的靶向治疗,抑制／逆转EMT提供新的理论支持和实验依据。