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血栓性疾病是严重威胁人类健康的疾病之一。目前的溶栓剂链激酶、尿激酶及其突变体等存在再通不完全、血栓再形成、出血和过敏反应等缺陷。葡激酶(Staphylokinase,SAK)具有与组织型纤溶酶原激活剂相当的溶栓活性,并有更高的纤维蛋白专一性,是很有应用前景的溶栓剂。为降低野生型Sak的免疫原性,采用重组改构葡激酶突变质粒,将其在大肠杆菌中进行表达。本研究将已构建的DH5α/pBV220/rSAK工程菌株生产工艺探索,从常用培养基中筛选出最适合发酵和rSAK表达的M9培养基,采用单因子实验方法对M9培养基中的碳源和氮源进行了逐个筛选,确定碳源为葡萄糖,氮源为蛋白胨和酵母粉,设计正交试验,对培养基配方进行优化,确定出较适合的培养基,同时在培养基中添加Mg2+以加速菌体的生长。摇瓶发酵工艺研究中系统地考察了培养温度、诱导时机、诱导维持时间对菌体生长和rSAK表达的影响,也对发酵液初始pH值、溶氧、种子菌龄、接种量等工艺条件进行了研究,选择出最佳的摇瓶培养条件:菌种30℃进行培养,发酵液初始pH值为7.2-7.4,摇床转速180r/min左右,在对数生长前期升温至42℃诱导表达3h,然后转入35℃再培养,可获得较高的菌体产量和rSAK的表达量。此时rSAK表达量为24.6%,产量是0.276g/L。另外,深层发酵特性研究表明摇瓶中溶氧不足是限制菌体生长和rSAK表达的主要原因。发酵罐间歇培养研究,确定出最优培养条件为:通过调节通气量和搅拌速度控制溶氧大于50,采用10%-15%的接种量,在A600达2.0时诱导可获得最高的rSAK产量,达到0.626g/L,是摇瓶中产量的2.3倍。深层发酵特性研究,发现在培养结束时培养液中仍含有丰富的营养物质,推测如果采用分批补料培养可以进一步提高rSAK产量。纯化制备的蛋白按照《中国生物制品规程》相关原则进行质量研究,其中纯度≥95.0%、残余菌体蛋白残留量≤0.05%、内毒素含量<10EU/mg等,制备出符合药物临床前评价所需的rSAK改构蛋白。体外效价研究证实该蛋白具有生物学活性,为进一步的应用开发奠定基础。