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第一章人脑源性神经营养因子基因克隆及其表达载体构建;目的:脑源性神经因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)作为神经生长因子家族成员,与外周听觉系统有着密切关系,不仅对耳蜗前庭神经元的发育、增殖分化、存活起重要作用,而且对损伤后神经元的修复、存活与功能重塑也起了重要作用.近年来神经生长因子家族一些成员纷纷被克隆并应用于内耳疾病的防治,已取得可喜进展.在此基础上,该研究对人脑源性神经营养因子(hBDNF)进行克隆,并构建hBDNF真核表达载体pcDNA3.1(-)-BDNF,为耳聋防治进一步研究提供了基因来源.结论:成功构建了含BDNF基因的真核表达载体:pcDNA3.1(-)-BDNF,为开展内耳转基因研究提供了重要的基因来源.第二章Lipofectamine2000介导BDNF基因转染耳蜗实验研究;目的:在耳蜗基因治疗中,安全可靠的基因导入途径是实现耳蜗内基因治疗的关键,获得稳定、高效目的基因表达是我们治疗目的.为此我们以重组质粒pcDNA3.1(-)-BDNF作为外源性基因,与脂质体Lipofectamine2000一起转染耳蜗.观察该过程对听觉功能的影响与耳蜗组织形态的变化,并确定转导细胞的表达分布,为今后的内耳基因治疗的深入研究打下基础.方法:采用显微注射技术经豚鼠耳蜗底周鼓阶钻孔向实验动物外淋巴腔中导入脂质体与质粒基因复合物,对照组耳蜗内注射人工外淋巴液.动物分别在术后7天、14天、28天不同时间点麻醉处死,并在术前与处死前一天行耳蜗复合动作电位(CAP)阈值测定.耳蜗标本经固定、脱钙、石腊包埋后行HE染色观察耳蜗组织病理学变化;BDNF免疫组化方法检测基因转染耳蜗表达.第三章骨髓基质细胞及其联合质粒-脂质体复合物耳蜗内移植的初步研究;目的:将标记的骨髓基质细胞移植于耳蜗内,初步观察它在耳蜗内的存活情况;在此基础上,将细胞联同脂质体与质粒pcDNA3.1(-)-BDNF种植于耳蜗,初步观察体内环境下BDNF基因转染修饰骨髓基质细胞的情况,从而为今后的体细胞或转基因治疗内耳疾病研究打下良好的基础.方法:将豚鼠骨髓基质细胞分离培养,用DAPI加以标记,采用耳蜗基因导入途径,经耳蜗底周鼓阶钻孔移植细胞以及质粒和脂质体复合物.10天后动物麻醉并处死,耳蜗标本行石腊包埋切片,行荧光检测移植细胞存活情况,神经丝蛋白免疫组化染色观察移植细胞分化与转归,BDNF免疫组化实验观察hBDNF对移植细胞的转染.