论文部分内容阅读
银屑病是一种常见的慢性复发性炎症性皮肤病,给患者的身心带来极大的痛苦,严重影响着患者的生活质量。在银屑病的治疗方面,维生素D3类似物、维A酸的出现都起到了革命性的作用。目前维生素D3类似物为美国及欧洲的轻、中度银屑病的第一外用药,外用第三代维A酸治疗寻常型银屑病也已逐渐被推广。目前维生素D3类似物及维A酸两类药物用于治疗银屑病的作用机制仍在研究之中。国内外临床治疗银屑病的过程中,联合应用维生素D3类似物和维A酸类药物,能起到降低药物使用浓度及副作用而增强疗效的作用。由此,在蛋白质水平上,研究维生素D3类似物、维A酸以及该两类药物的联合应用对KC的影响,可为该两类药物的作用机制及其临床联合应用提供更多的理论依据。
本研究应用差异蛋白质组学的方法,通过对HaCaT细胞及其药物诱导后细胞全蛋白的分析比较,研究骨化三醇、芳维A酸氨丁三醇及两药联合应用对KC蛋白质表达的影响,寻找维生素D3类似物及其联合芳维A酸氨丁三醇作用机制的相关靶蛋白,从而为银屑病的治疗,尤其骨化三醇联合维A酸治疗,提供理论依据。
第一部分 HaCaT细胞的培养、药物干预及蛋白质样品的制备
目的：人表皮KC(HaCaT 细胞系)的培养、药物诱导,以及细胞全蛋白的提取,为后续的蛋白质组学分析提供基础。
方法:HaCaT细胞常规培养、传代,待细胞生长至约80％融合,改用无血清的K-CSF培养24小时后,分别加入新鲜配制的10-8mol/L的骨化三醇、10-7mol/L的AT及两药同时加入,阴性对照组加等量的无血清K-CSF,每种条件设置3个复孔,避光培养48小时后收集阴性对照组及各加药组细胞,采用反复冻融法提取细胞全蛋白,用Bradford法测定蛋白浓度,蛋白样品分装,置-80℃保存。
结果：
1.采用含9M尿素、4％(W/V)CHAPS等的细胞裂解液,-80℃冰箱反复冻融3-4次,四组细胞提取的全蛋白的浓度较高。
2.骨化三醇与AT对HaCaT细胞蛋白质的表达的影响无统计学差别；骨化三醇及AT与阴性对照相比无统计学差异；两药联合应用可明显降低细胞的蛋白质表达,与阴性对照及两者单独作用时的蛋白质浓度相比较,均有统计学意义。
结论：骨化三醇和AT联合作用时其抑制蛋白质表达的功能强于任一药物的单独作用。
第二部分 HaCaT细胞全蛋白的2-DE图谱的建立
目的：建立适用于HaCaT细胞的分辨率高和重复性好的2-DE平台,并使用该平台对实验第一部分得到的蛋白样品进行二维电泳,得到各组蛋白质二维分离的凝胶图谱。
方法：以固相pH梯度等电聚焦为第一向和垂直SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳为第二向,按照Bio-Rad 2-DE的流程摸索出适用于HaCaT细胞全蛋白的水化上样缓冲液浓度、等电聚焦(IE F)电泳程序、高效的二向分离胶凝浓度等条件。然后在同样条件下对前期制备的蛋白质样品进行固相pH梯度2-DE分离、银染,并图像扫描。
结果：采用长17cm、pH 3-10,非线性NL预制胶条,浓度为12％的分离胶,增加上样缓冲液中DTT的含量,等电聚焦升压顺利,所得图像纵纹、横纹少,蛋白点清晰,无明显脱尾等现象。
结论：本研究成功建立了HaCaT细胞全蛋白的2-DE展示平台,建立了图像清晰、分辨率高和重复性好的固相PH梯度2-DE图谱,得到了较好的蛋白质分离及展示效果。
第三部分凝胶图像的分析和差异蛋白质的质谱鉴定
目的：寻找阴性对照、骨化三醇、AT及联合用药四组KC蛋白质表达的差异,揭示骨化三醇、AT药物作用后蛋白表达的质与量上与正常角质细胞的差异。通过质谱分析为差异的蛋白质定性,从而揭示药物作用机制中的靶蛋白。
方法：使用ImageMaster 2D Platinum 5.0软件对2-DE图谱进行匹配分析,并以同实验条件下的建立的正常角质细胞的2-DE图谱及人类正常角质细胞2-DE数据库中的结果作为参照,筛选出存在差异的蛋白质点。切取符合质谱分析浓度要求的10个差异蛋白质点,进行胶内酶解,后通过基质辅助激光解吸附飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对蛋白质点进行氨基酸序列分析,依据酶解肽片断的质量,通过Mascot软件查询SWISS-PROT蛋白数据库,经软件自动运算得出Mascot得分,确定出被测蛋白质的可能属性及名称。
结果：
1、建立了一个包含3000余个蛋白质点的KC的双向电泳图谱。四组细胞的3块凝胶的平均蛋白质点数分别为3143±284、3081±404、2930±729、3222±526。
2、同一组细胞的同一蛋白点在3块胶的重复性好,其变异程度的平均值为0.2552。
3、四组数据间两两比较分析不同药物作用后的双向凝胶电泳图谱,差别1.1倍以上的蛋白质点数分别有10-38个,其中联合用药组与骨化三醇组以及骨化三醇组和AT组间的差异点较多。
4、送检10个蛋白质,检测出4个,分别为:Serpin B1,IRF4的irf结构域立体结构的A链,fascin homolog1,还有一种由1081个氨基酸组成的未命名的蛋白质。
结论：使用ImageMaster 2D Platinum 5.0软件对凝较图谱进行分析,本实验的2DE重复性较好。两药联合作用后出现广泛的蛋白质表达受抑制。Serpin B1的表达量在联合用药与空白相比及其与AT组相比时均增加。fascin homolog 1在骨化三醇作用后表达量增加。IRF4的irf结构域立体结构的A链在联合用药后较单独用药时表达下降。