豆科植物广泛分布于全世界,是人类食物中蛋白质、油和蔬菜的重要来源之一。此外,某些豆科物种又是优良的饲草,为牲畜提供了大量的蛋白质。因此开展豆科物种基因功能研究具有重要的意义。蒺藜苜蓿是二倍体物种,其具有生活周期短、结实率和遗传转化效率高等特点。此外,蒺藜苜蓿基因组已完成测序,同时还构建了相应的突变体库。因此,蒺藜苜蓿作为豆科模式植物开始被广泛和深入地开展研究。叶是植物进行光合作用的主要器官。叶原基起始于顶端分生组织的周边区,在一系列基因和小RNA精确调控下,叶原基建立近-远轴、基-顶轴和中-侧轴极性,引导原基细胞朝着特定的方向分裂和分化,最终发育成具有一定形态和大小的叶片。近年来分子生物学和遗传学研究结果表明,多种转录因子家族基因、miRNA/tasiRNA和细胞周期相关因子组成一个复杂的遗传调控网络,调节植物叶片的极性建成。然而,复叶物种的叶发育遗传调控机理仍然不清楚。在本研究中,我们以豆科模式植物蒺藜苜蓿为研究材料,通过正向遗传学筛选Tnt1插入的突变体库,发现了两个复叶发育异常的突变体flower can not open 1(fcno1)和no stem1(ns1),并对FCNO1和NS1基因调控复叶发育的分子机制开展了研究。此外,我们还对MtPHAN和MtAGO7基因在蒺藜苜蓿复叶发育中的冗余功能进行了分析,并对其下游基因进行了功能鉴定。最后,我们初步分析了MtmiR319/MtTCPs调控单元在蒺藜苜蓿根瘤发育中的功能。本文的主要研究结果如下:1.FCNO1基因在蒺藜苜蓿复叶发育中的功能研究通过正向遗传学筛选蒺藜苜蓿Tnt1突变体库,我们发现了四个具有相同表型的突变体flower can not open 1(fcno1)。fcno1突变体花原基发育正常,不育表型是由于花不能开放无法完成受精导致。fcno1突变体叶与花、叶与叶以及小叶间发生黏连,这种器官间的黏连会随着发育进程的推进及叶片的展开而消失。fcno1突变体最显著的表型是叶片小叶数目增多,叶复杂性增加。FCNO1编码超长链脂肪酸合成途径的限速酶β-酮脂酰CoA合成酶,是拟南芥FDH(AtKCS10)的同源基因。FCNO1特异在SAM最外层细胞(L1细胞)中表达。FCNO1的功能缺失导致超长链脂肪酸各组分含量的减少,进而影响角质层蜡质的沉积,造成角质层发育缺陷。同时,超长链脂肪酸含量的减少改变了植物细胞膜的完整性,导致生长素输出蛋白SLM1/PIN1在最外层细胞中的极性定位发生改变。SLM1/PIN1极性定位的改变导致顶端分生组织(SAM)和叶原基中生长素梯度改变,进而诱导异位小叶的起始。通过正向遗传学筛选Tnt1突变体库,我们还发现两个花不能打开的突变体flower can not open2(fcno2)。fcno2突变体叶片也发生黏连,但是叶片的复杂性没有增加。FCN02编码细胞色素P450单氧化酶,是拟南芥ATT1(CYP86A2)的同源基因,参与催化脂肪酸氧化反应进而影响角质层的沉积。此外,我们通过反向遗传学筛选获得了KCS基因家族成员MtKCS12的突变体,mtkcs12突变体叶片表型与野生型一致。原位杂交结果表明,fcno1、fcno2和mtkcs12叶片表型的不同是由基因表达模式的差异造成的。FCNO1特异在最外层细胞中表达,FCNO2在整个SAM和叶原基中表达,而MtKCS12不在SAM和叶原基中表达。遗传证据表明,FCNO1和FCNO2在蒺藜苜蓿复叶发育中功能部分冗余,但是在花发育上,FCNO1上起主要作用。2.NS 基因在蒺藜苜蓿复叶发育中的功能研究通过正向遗传学筛选蒺藜苜蓿Tnt1突变体库,我们发现了两个具有相同表型的突变体no stem1(ns1)。ns1突变体最明显的表型是缺失地上茎和侧枝的发育。NS1 编码 WUSCHEL-RELATED HOMEOBOX(WOX)家族转录因子,是拟南芥WUSCHEL(WUS 的同源基因。NS1在SAM和侧生分生组织(AM)的组织中心、花和叶边缘中均有表达。ns1突变体的SAM和AM发育异常,表明NS1调控分生组织的形成和维持。进一步研究表明,ns1与slm1突变体具有相似的复叶发育缺陷,如叶片小叶数目改变、叶边缘锯齿变的光滑。原位杂交结果表明,ns1突变体复叶模式的改变是由于SAM的形成缺陷改变了SLM1的表达模式,影响了生长素在SAM的分布。NS1作为抑制性转录因子,可通过其WUS结构域和EAR基序与转录共抑制因子MtTPL/MtTPRs相互作用形成蛋白复合体来调节SAM的发育。遗传证据表明,ns1突变体叶边缘锯齿变的光滑是由于叶边缘生长素响应减弱导致,这些结果暗示NS1可能通过间接的方式调控生长素响应并以SLM1依赖的方式调节叶边缘锯齿的形成。3.MtPHAN/MtAGO 基因在蒺藜苜蓿复叶发育中的功能研究MtPHAN编码MYB转录因子,是拟南芥ASYMETRIC LEAVES1(AS1)的同源基因,参与蒺藜苜蓿叶片的极性建成。MtHAN最初在整个叶原基中表达,随后特异在叶原基的近轴面表达,mtphan突变体叶片极性呈现部分远轴化。MtAG07是拟南芥ARGONAUTE7(AGO7)的同源基因,参与ta-siRNA的生物合成来负调控MrARF3/4a/4b的表达。MtAGO7在叶原基近轴面表达,mtago7突变体最显著的表型是叶片边缘浅裂。mtphan和mtago7单突变体的叶片均为三个小叶,但是mtphan mtago7双突变体叶片小叶数目增多、复叶模式改变,表明MtPHAN和MtAG07以冗余的方式调控复叶的发育。进一步分析表明,mtphanmtago7叶片的表型与palm1突变体和35Spro:MtKNIXI转基因植株叶片的表型类似。同时,在mtphanmtago7中,MtKNOXI表达水平升高,而PALM1表达水平降低,表明MtPHAN和MtAG07对MtKNOXI和PALM1有相反的调控。先前的研究表明,过表达KNOXI可直接激活细胞分裂素合成基因IPT的表达。在mtphanmtago7中细胞分裂素的含量显著增加,进一步证明KNOXI上调导致了复叶模式的改变。另外,PALM1还能抑制KNOXI基因的功能,但是在paalm1突变体中敲除所有MtKNOXI并不能恢复palm1的表型,表明palm1突变体异位小叶的产生不依赖MtKNOXI。此外,PALM1作为抑制性转录因子可招募MtTPL/MtTPRs形成复合体来抑制MtIPT基因的表达,同时过表达PALM1植株叶片中细胞分裂素的含量减少。因此,PALM1和MtKNOXI拮抗调控下游MtIPT基因的表达来控制复叶发育。外源施加6-BA和CKI进一步证明,mtphanmtago7双突变体小叶增多的表型是由细胞分裂素含量的增加导致。4.MtmiR319/MtTCP调控单元在蒺藜苜蓿根瘤发育中的功能TCP蛋白是植物特异性转录因子,参与调控植物生长和发育的多个方面。然而,TCP在豆科植物中的功能,特别是在根瘤发育中的功能仍不清楚。通过全基因组分析,发现蒺藜苜蓿共含有21个MtTCP基因。这些MtTCP基因可分为ClassⅠ和Class Ⅱ两大类,Class Ⅱ又可分为CIN和CYC/TB1两个亚类。Class IMtTCP在所有器官中均表达,CIN亚类MtTCP主要在叶片中表达,CYC/TB1亚类MtTCP主要在花中表达。此外,除MtmiR319的靶基因MtTCP3、TCP4和MtTCP10A外,其他MtTCP基因均在根瘤中下调表达。过表达MtmiR319A导致根瘤数目显著减少,表明MtmiR319靶向调控的MtTCP在结瘤中发挥重要功能。