研究背景：.银屑病(Psoriasis)是最常见的慢性炎症性增生性皮肤病之一,病情顽固,易复发,且可造成全身系统损害。其主要的组织病理学改变为角质形成细胞异常增生、角化不全、角化过度、血管生成和炎性细胞浸润。其病因和发病机制尚未完全明确,也无特效治疗药物,目前尚无有效根治方法,严重影响患者的生活质量,甚至生存周期,是目前国内外重点关注的疾病之一。研究多显示免疫平衡失调和(或)表皮角质形成细胞增生异常与其发病密切相关,其中细胞因子对角质形成细胞的增生和分化、病理和细胞动力学均有一定作用。目前已证实T细胞活化及T细胞一角质形成细胞调节水平异常等在银屑病发病机制中起着非常重要的作用,且其发病过程与多种炎症细胞、细胞因子及生长因子有关近年来JAK/STAT信号转导通路与银屑病的关系受到越来越多的关注,大量的研究工作表明JAK/STAT信号转导通路是细胞因子信息内传最重要的一条通道。活化的T细胞分泌的多种细胞因子与细胞表面相应受体结合,通过JAK/STAT信号转导通路将胞外信号传递至胞核内,调节角质形成细胞等细胞的增殖和分化,从而在银屑病的发病过程中起到重要的作用。但STAT转导机制的准确作用尚未完全清楚。国内外大量研究结果表明在银屑病皮损区,激活的T细胞可以产生一系列的细胞因子,而这些细胞因子与角质形成细胞表面相应受体结合后,可能引起角质形成细胞内角蛋白表达模式的改变。且研究发现K17蛋白(Keratin17,K17)在银屑病皮损中高表达,但在正常皮肤都未见表达,并已被认为是银屑病的标志物之一。其中细胞因子IFN-γ可激活STAT1,诱导表皮基底层以上部分角质形成细胞表达角蛋白K17。而史晓蔚等研究也表明角质形成细胞中IL-17A可以通过STAT1和STAT3途径剂量依赖性的上调K17的表达。目前多数研究已表明,银屑病患者皮损的表皮中下层细胞的胞浆及胞核中高表达STAT3蛋白,其在血液中的表达也显著升高,并且与病情的严重程度呈正相关。同时,有研究表明STAT3的异常活化可以促进细胞分化增殖、抑制细胞凋亡,最终导致细胞增殖异常和(或)恶性转化,从而导致多种疾病的发生。提示STAT3在银屑病发病中起重要作用。因此,STAT1和STAT3在角质形成细胞异常增殖的银屑病患者中是否存在高表达,并协同导致银屑病发病值得深入研究。近来,已清楚至少有三类不同的抑制蛋白与细胞因子信号转导的负调节有关。其中SOCS家族中许多成员是大多数细胞因子信号转导通路的负性调节因子,参与许多炎症性疾病免疫学发病。其中SOCS家族中的SOCS1, SOCS3在银屑病的发病过程中的作用越来越受到关注。研究发现SOCS1是IFN-信号活动的负性反馈调节因子,SOCS-3可以抑制IL-2引起的炎症反应,而IFN-、IL-2为角质形成细胞最强大的炎症前细胞因子,IFN-、IL-2通过诱导JAK-STAT信号转导通路,形成角质形成细胞免疫炎性反应。尽管多数研究证实了JAK/STAT及其负性调控因子在银屑病发病中的重要作用,然而其具体的作用机制尚未完全清楚,需要进一步深入探讨。卡泊三醇是1,25(OH)2D3的类似物,临床研究证实1,25(OH)2D3及其类似物治疗银屑病疗效确切。实验研究发现,其与骨化三醇受体有较强的亲合力,可减少银屑病患者的IL-6含量和分布,以及活化的表皮T淋巴细胞数。从而使银屑病皮损的增生和分化异常得以纠正。同时,也发现CPT的抗增殖效应与pRB的磷酸化有关,去磷酸化的pRB与UE2F等转录因子结合后,可使多种细胞周期调控蛋白和正性转录因子(如CyclinD1、CDK4、C-Myc)的表达降低,同时,CPT可促使TGF-β1的合成增加,而TGF-β1可以抑制CDK4等的表达。综合以上这些研究结果,JAK/STAT信号转导途径在银屑病发病中作用机制及卡泊三醇对其的影响值得深入研究,是否可以提出卡泊三醇可能直接作用于JAK/STAT信号转导途径,从而达到治疗银屑病的目的呢?为了解决上述问题,本研究以人角质形成细胞HaCaT细胞株为研究对象,利用RNA干扰技术,设计针对STAT1/STAT3的特异性siRNA,再将沉默序列转染至HaCaT细胞中,分别沉默STAT1/STAT3基因。然后,采用Q-PCR和Western-blot检测沉默后STAT1/STAT3沉默后的效果,筛选出最佳沉默序列,以期进一步探讨银屑病的发病机制及卡泊三醇治疗银屑病的作用机制。目的：1.通过RNA干扰技术建立STAT3/STAT1低表达的角质形成细胞,研究STAT3/STAT1的表达水平及负性调节因子(SOCS1/SOCS3)对银屑病的生物学影响及基因调控机制。2.探讨卡泊三醇对JAK/STAT信号转导途径的影响,从而确认卡泊三醇治疗银屑病的可能作用靶点及机制。方法：1.使用DMEM/10%FBS培养基培养HaCaT细胞。2.分别用0.1nM、1nM、10nM、100nM、1uM、10uM浓度的卡泊三醇处理HaCaT细胞,不施加任何干预HaCaT细胞作为空白对照。分别于培养0h,12h,24h,48h,72h后收获细胞,利用MTS观察不同浓度的卡泊三醇处理后的HaCaT细胞在增殖情况,得出最佳OD值,筛选出卡泊三醇最佳抑制HaCaT细胞增殖的浓度,观察是否呈剂量依赖关系。3.运用Q-PCR和Western-blot检测空白组及最佳卡泊三醇抑制处理后的HaCaT细胞的STAT1、STAT3、P-STAT1、P-STAT1、SOCS1、SOCS3基因及蛋白变化情况。4.siRNA-STAT1/siRNA-STAT3的构建和转染：①从基因数据库(如www.ncbi.nlm.nih.gov)搜索人的STAT3mRNA全基因序列,利用BLAST软件进行同源性分析。②将对比好的STAT1/STAT3mRNA全基因序列作为模版,根据siRNA的设计原则,分别设计三对siRNA。③按照设计的序列,合成siRNA-STAT1-001/siRNA-STAT3-001、siRNA-STAT1-002/siRNA-STAT3-002、 siRNA-STAT1-003/siRNA-STAT3-003,同时设立阴性对照组④采用不同浓度的Lipo2000转染试剂将制备好的上述siRNA转导至HaCaT细胞中。5.沉默效果检测：采用Q-PCR和Western-blot检测RNAi沉默后STAT1、 STAT3基因及蛋白表达情况,并筛选出最佳沉默序列。6.扩大培养成功沉默的HaCaT细胞株,通过MTS、Q-PCR和Western-blot等方法检测表达分别沉默STAT1/STAT3基因后,对HaCaT细胞株的增殖影响及其对JAK/STAT号通路中相关基因的影响。7.药物干预：分别运用上述筛选的最佳siRNA-STAT3/siRNA-STAT3,分别沉默STAT1、STAT3,结合luM浓度的卡泊三醇处理24h、48、72h后,运用定Q-PCR和Western-blot检测STAT1、STAT3、P-STAT1、P-STAT1、SOCS1、 SOCS3基因及蛋白变化情况。8.统计学分析：结果采用SPSS13.0软件进行数据处理,细胞增殖等单因素均数比较若方差齐使用One-Way ANOVA方差分析,LSD方法进行多重比较；若方差不齐则使用采用近似F检验(Welch方法)代替方差分析后采用Dunnett T3方法进行多重比较；MTS多因素均数比较使用析因设计方差分析进行统计：计量资料用均数±标准差表示,P<0.05表示差异有统计学意义。结果：1.分别以0.1nM,1nM,10nM,102nM,103nM,104nM浓度的卡泊三醇处理HaCaT细胞株后,用MTS法检测卡泊三醇对HaCaT细胞细胞增殖影响。其中不同浓度细胞间增值率的差别有统计学意义(F=29.521,P<0.001);12h、24h、48h和72h的OD值进行析因设计的方差分析,差别有统计学意义(F=2005.857,P<0.001)；时间和细胞之间有交互效应(F=3.406,P<0.001)。其12h、24h、48h和72h时组间的OD值均有明显差异(均P<0.001)。结合多重比较结果显示：1nM,10nM,102nM,103nM,104nM浓度对细胞增值影响的差异无统计学意义((P>0.05),而0、O.1nM和以上各组间差别有统计学意义(P<0.001)。综上所述,在后续试验中我们将采用10nM卡泊三醇进行后续试验。并在此浓度下运用Q-PCR和Western-blot检测STAT1、STAT3、P-STAT1、 P-STAT1、SOCS1、SOCS3基因和蛋白水平的表达均下降。2.采用不同浓度的上述siRNA干扰序列转染至HaCaT细胞中,转染后24h后于荧光显微镜下观察到大量绿色荧光。采用Q-PCR和Western-blot检测RNAi沉默后STAT1、STAT3基因及蛋白表达情况,证实STAT1/STAT3在HaCaT细胞株中被沉默。并且筛选出siRNA-STAT1-003-50um, siRNA-STAT3-001-50um序列沉默的效果最好。3.分别将siRNA-STAT1/siRNA-STAT3成功转染至HaCaT细胞后,将细胞分为8个组：A：空白组；B.lipo2000; C.NCsiRNA; D.10nM卡波三醇；E.STAT1siRNA; F.STAT3siRNA; G.STAT1siRNA+10nM卡泊三醇；H.STAT3siRNA+10nM卡泊三醇的。其中A、B、C组中STAT1、STAT3、 P-STAT1、P-STAT1、SOCS1、SOCS3在基因和蛋白水平的表达无明显差异(P>0.05)。D、E、F、G、H中的STAT1、STAT3、P-STAT1、P-STAT1、 SOCS1、SOCS3的基因和蛋白水平的表达较述三组均下降。发现单纯卡泊三醇处理组和SiRNA-STAT1/SiRNA-STAT3组的JAK/STAT通路的相关因子的基因及蛋白水平都下降,各组之间相差不明显,而且卡泊三醇+siRNA-STAT1-003(G组)与siRNA-STAT1-003(E组)STAT1/p-STAT1基因、蛋白的表达水平无明显差异。卡泊三醇+siRNA-STAT3-001(H组)与siRNA-STAT3-001(F组)STAT3/p-STAT3基因、蛋白的表达水平无明显差异。4.用MTS法检测上述八组的HaCaT细胞细胞增殖情况。其中不同组细胞间增值率的差别有统计学意义(F=112.243,P<0.001);0h、24h、48h和72h的OD值进行析因设计的方差分析,差别有统计学意义(F=3169.76,P<0.001)；时间和分组之间有交互效应(F=32.211,P<0.001),其中0h时8组间的OD值无明显差异(P=0.922),24h、48h和72h时均有明显差异(均P<0.001)。结合多重比较结果显示：其中A、B、C三组对细胞增值影响的差异无统计学意义(P>0.05),而D、E、F、G、H五个干扰组和以上各组间差别有统计学意义(P<0.001),并且D、E、F、G、H各组间对细胞的增殖影响的差异无统计学意义(P>0.05)。结论：1.运用卡泊三醇处理HaCaT细胞株后,STAT1/STAT3及其负性调节因子(SOCS1、SOCS3)的基因和蛋白表达下调,并且HaCaT细胞增殖也受到抑制。进一步运用RNAi分别沉默STAT1/STAT3后,各组中STAT1/STAT3及其负性调节因子(SOCS1、SOCS3)的基因和蛋白表达同样下调,从而可能提示了卡泊三醇可能通过JAT/STAT信号通路影响HaCaT细胞的分化、增殖。由此推测,JAT/STAT通路是银屑病发病的一个潜在关键点,通过沉默STAT1/STAT3,下调其表达,可成为靶向治疗银屑病的一种新方法。2.卡泊三醇处理组和siRNA-STATl-003、siRNA-STAT3-001组的STAT1、 STAT3、P-STAT1、P-STAT1、SOCS1、SOCS3的基因及蛋白水平都下降,相差不明显,说明卡泊三醇可能通过抑制JAK/STAT通路的激活发挥治疗作用。而且卡泊三醇+siRNA-STAT1-003(G组)与siRNA-STAT1-003(E组)STAT1/p-STAT1基因、蛋白的表达水平无明显差异,卡泊三醇+siRNA-STAT3-001(H组)与siRNA-STAT3-001(F组)STAT3/p-STAT3基因、蛋白的表达水平无明显差异。进一步说明卡泊三醇可能通过JAK/STAT途径下调STAT1和STAT3的表达,从而抑制角质形成细胞的增殖。结合本实验结果,STAT1与STAT3两者之间可能存在着一定的内在联系,但具体的机制尚需进一步的深入研究。3.本课题有助于深入了解JAK/STAT信号转导通路及其负性调节因子(SOCS1、SOCS3)在银屑病发病中的作用以及卡泊三醇对其相关信号通路的影响,为今后进一步的研究、开发针对银屑病炎症中的细胞信号转导途径中相关的、潜在的药物作用靶点的抗银屑病药物在临床应用提供理论依据。