近年来,结直肠癌的治疗有了长足的发展,尤其是靶向药物的应用使得晚期结直肠癌患者生存期有了明显提高,但是,即使是靶向药物在使用过程中也会出现耐药问题,对于进行了多线药物治疗的结直肠癌患者,如何进行进一步延长患者生存期仍是医学面临的难题。自从2015年报道了PD-1抑制剂治疗MSI晚期结直肠癌患者有明显疗效后,对于结直肠癌的免疫治疗以及寻找合适的免疫标记物成为研究的热点。目前,结直肠癌的诊断和治疗已经进入分子分型水平,临床主要检测微卫星不稳定性（Microsatellite instability,MSI）、RAS基因、BRAF基因等。RAS基因是表皮生长因子受体（EGFR）的下游基因,RAS基因突变可以激活RAS/MAPK信号通路,导致结直肠癌对抗EGFR靶向药物产生耐药。微卫星不稳定性途径是结直肠癌发生发展一个重要途径,微卫星不稳定可以导致肿瘤细胞内基因突变的大量产生,进而形成大量新的抗原,增加机体的免疫识别和免疫应答,产生抑制肿瘤的状态。而肿瘤免疫微环境对于抗肿瘤起着重要作用,微卫星不稳定与肿瘤免疫微环境是否存在相互影响,以及肿瘤治疗过程中肿瘤免疫微环境是否会发生改变,如何发挥作用等,需要深入研究。第一部分MSI和KRAS基因突变在结直肠癌中的表达情况及相关性分析目的:探讨在结直肠癌中MSI状态和KRAS基因突变情况,并探讨两者之间是否存在相关性方法:回顾性分析2015.2至2016.12在河北医科大学第四医院行结直肠癌手术治疗的731例患者临床及病理资料。收集患者的临床病理信息、术后组织标本KRAS基因检测结果,应用免疫组化法检测患者MMR蛋白（MLH1、MSH2、MSH6和PMS2）表达并收集临床资料,使用SPSS 20.0统计学软件进行分析。结果:1.结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）患者中MSI状态通过免疫组化法分析731例病例中MMR蛋白的表达情况,根据检测结果进行MSI分型,结果显示:微卫星高度不稳定（High-level microsatellite instability,MSI-H）68例,其发生率为9.3%,微卫星低度不稳定（Low-level microsatellite instability,MSI-L）12例,其发生率为1.3%,微卫星稳定（Microsatellite stable,MSS）654例,其发生率为89.4%。2.CRC患者肿瘤组织中KRAS基因突变情况通过PCR法检测731例患者肿瘤组织KRAS基因突变情况,有291例（39.2%）发生KRAS基因突变,共有223例发生12号密码子突变,突变率为30.0%,在12密码子中p.G12D突变最常见,共109例突变,突变率为14.7%,其次是12密码子中p.G13V,共69例发生突变,突变率为9.3%。3.MSI状态与散发性CRC患者临床病理特征的相关性通过对MSS患者临床病理特征对比分析发现:MSI-H组患者在肿瘤发生部位、发病年龄、组织分化程度、神经受侵、临床分期等方面存在统计学差异（P<0.05）,主要表现为,MSI-H组患者的发病年龄偏低,右半结肠比例较多,组织类型多为低分化或黏液腺癌,淋巴结转移较少。而在肿瘤侵及深度、脉管瘤栓、远处转移及性别等两者之间无明显差异。4.KRAS基因突变情况与散发性CRC患者临床病理特征的相关性KRAS基因突变型与野生型患者对比结果显示:KRAS基因突变在结直肠癌患者性别和肿瘤病理类型方面存在统计学差异（P<0.05）,表现为女性、低分化和黏液腺癌更多见。而在年龄、肿瘤原发位置、分化程度、侵及深度、脉管瘤栓、神经受侵、淋巴结转移、远处转移等方面,两者之间没有的统计学差异（P>0.05）。5.KRAS基因突变与MSI分型在CRC患者的关联性分析MSS组CRC患者中共有266例发生KRAS基因突变,发生率40.1%,MSI组CRC患者中21例KRAS基因突变,发生率30.8%。MSS组CRC患者KRAS基因突变率与MSI组CRC患者KRAS基因突变率之间差异无统计学意义（P>0.05）。在MSI组CRC患者和MSS组CRC患者两组中分析不同密码子的突变情况,发现12、13密码子突变率差异有统计学意义（P<0.05）。小结:1.在CRC患者中MSI-H的发生率为9.3%。MSI与患者发病年龄、肿瘤部位、分化程度、TNM分期和淋巴转移密切相关。2.在结直肠癌患者中KRAS基因的突变率为39.2%。其中最常见的突变位点是12和13密码子。KRAS突变仅和患者性别、肿瘤病理类型有关。3.在CRC患者中MSI状态与KRAS基因状态无相关性。第二部分MSI状态对结直肠癌免疫微环境的影响目的:研究MSI不同状态结直肠癌组织中CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、CD34、PD-L1分子的表达变化情况,探讨MSI和免疫细胞之间的作用关系方法:选取2015.2至2016.12在河北医科大学第四医院行结直肠癌手术治疗的731例患者临床及病理资料,选出MSI-H患者65例,并匹配MSS患者65例。通过免疫组化法检测肿瘤组织中CD8⁺T细胞、CD4⁺T细胞、CD34和PD-L1分子的表达,使用SPSS 20.0统计学软件进行分析。结果:1.CD8⁺T细胞在37例CRC患者中高表达,占28.4%,93例低表达,占71.6%。CD8⁺T细胞在MSI组患者中的表达明显高于MSS组,两者之间有统计学差异（P<0.05）。2.CD4⁺T细胞在MSI组CRC患者中37例高表达,占54.6%,在MSS组CRC患者中34例为高表达,占52.3%。CD4⁺T细胞在MSI组和MSS组患者中表达比例没有区别,无统计学差异（P>0.05）。3.CD34在MSI组和MSS组CRC患者中均为高表达,但是两者之间表达无区别,无统计学差异（P>0.05）.4.PD-L1在MSI组和MSS组CRC患者中表达无区别,无统计学差异（P>0.05）。小结:1.CD4⁺T细胞在MSI和MSS组CRC患者中的浸润没有区别,而CD8⁺T细胞在MSI组结直肠癌中表达明显升高,MSI组CRC组织中有更多的CD8⁺T细胞浸润,提示CD8⁺T细胞是主要的免疫效应细胞。2.CD34在MSI和MSS组CRC患者中均呈现高表达,但是两组间没有差异,提示肿瘤组织中血管密度较高。但是MSI对肿瘤血管增生没有影响。3.PD-L1在结直肠肿瘤细胞上的3例高表达,占4.61%,提示结直肠肿瘤的免疫逃逸机制中可能存在其它机制。第三部分直肠癌新辅助放化疗前后肿瘤组织免疫微环境变化研究目的:探讨直肠癌新辅助治疗前后肿瘤组织中CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞浸润的变化,寻找术前新辅助放化疗敏感的免疫标志物。方法:通过数据库筛选出符合条件的直肠癌患者52例,采用HE染色和免疫组化的方法评价放化疗前后肿瘤组织的CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞及CD4⁺/CD8⁺T细胞比值的变化,使用SPSS 20.0统计学软件进行分析。结果:1.直肠癌经NCRT后,MRI评价分期示肿瘤T₃、T₄分期合计降期率为46.2%,N+降至N₀分期为40.4%。2.CD4⁺T细胞浸润情况:CD4⁺T细胞数量在放疗后TIL 1级结直肠癌组织中增加2例,TIL2级中增加1例,TIL3级中减少3例。放疗前后CD4⁺T细胞TIL分级对比无统计学差异（P>0.05）。CD8⁺T细胞浸润情况:CD8⁺T细胞数量在放疗后TIL 1级结直肠癌组织中减少10例,TIL2级中增加6例,TIL3级中增加4例。放疗后CD8⁺T细胞TIL分级对比放疗前CD8⁺T细胞TIL有统计学差异（P<0.05）。3.放疗后直肠癌组织中CD4⁺/CD8⁺T细胞比值≤1的患者增加9例,比值>1的患者减少9例。放疗后直肠癌组织中CD4⁺/CD8⁺T细胞比值较放疗前明显降低,统计学差异显著（P<0.05）。4.利用免疫组化法检测放疗前直肠癌肿瘤组织中CD8⁺T细胞TIL密度越高,患者出现CR和PR的比例越多,SD和PD例数越少,分级对比有统计学差异（P<0.05）。放疗前直肠癌肿瘤组织中CD4⁺T细胞TIL密度与肿瘤组织局部疗效间,没有统计学差异（P>0.05）。小结:1.直肠癌患者经术前NCRT治疗后,MRI评价肿瘤T分期降期率为46.2%,N分期降期率为40.4%,提示术前NCRT治疗可以降低临床分期,提高手术治疗效果。2.CD8⁺T细胞在直肠癌放化疗后肿瘤组织中明显增多,而CD4+细胞CD4⁺T细胞没有明显变化。CD4⁺/CD8⁺T细胞比值在放疗后降低也可能与此有关。3.CD8⁺T细胞TIL分级越高,术后肿瘤退缩率越高,TIL分级可能是预测放疗敏感性的指标。结论:1.MSI状态和KRAS基因突变在结直肠癌中未检测到明显相关性,它们在结直肠癌发生和发展的不同途径发挥着作用。2.MSI结直肠癌中CD8⁺T细胞明显增加,提示MSI结直肠癌中CD8⁺T细胞浸润更多,其抗肿瘤的免疫效应也更强。3.PD-L1在结直肠癌组织中表达较低,提示结直肠癌的免疫逃逸机制中可能存在其它逃逸机制。4.在直肠癌肿瘤组织中CD8⁺T细胞TIL越多,放化疗效果越好,且放化疗后CD8⁺T细胞浸润增加更多,提示TIL可能是术前放化疗效果的预测指标,CD8⁺T细胞是其主要的效应细胞。