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氟苯尼考(Florfenicol,FF)和甲砜霉素(Thiamphenicol,TAP)属于氯霉素类广谱抗生素,主要用于治疗牛、家禽和猪呼吸道和肠道感染。众所周知,氯霉素对人类有着严重的危害,几乎已被世界各国列为禁用药物。氟苯尼考和甲砜霉素作为氯霉素的替代药物,虽然没有氯霉素毒性强,但是甲砜霉素可引起动物的可逆性贫血,氟苯尼考有一定的胚胎毒性,妊娠动物禁用。鉴于氟苯尼考和甲砜霉素对人体和动物的危害,中国、美国、日本及欧盟等许多国家和组织都规定了它们在动物组织中的最大残留限量。目前仪器分析的方法已经能够达到对这两种药物的检测要求,准确度和精密度都很高,但是仪器昂贵、样品前处理繁琐、对操作人员要求也很高,所以不适合用于现场的高通量筛选。酶联免疫分析方法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)具有灵敏、准确、高效等优点,适合用于大批量残留检测。本研究通过半抗原的设计、抗原的合成和单克隆抗体的制备,获得了能识别氟苯尼考和甲砜霉素的两种单克隆抗体。然后建立了相应的间接竞争ELISA方法,并初步应用于猪、鸡、鱼等可食性动物组织的检测。主要研究结果如下:1.半抗原和完全抗原的合成:以氟苯尼考为原料连接琥珀酸酐(HS),合成半抗原FF-HS,经质谱鉴定合成成功,然后通过N,N二环己基碳二亚胺(DCC)法分别与血蓝蛋白(keyhole limpet,KLH)、人血清白蛋白(albumin human serum,HSA)和卵清白蛋白(ovalbvmin,OVA)连接,制备了完全抗原 FF-HS-KLH、FF-HS-HSA 和FF-HS-OVA,经紫外光谱法鉴定合成成功;以氟苯尼考胺为原料,分别通过碳二亚胺(EDC)法和戊二醛(GA)法,偶联KLH、HSA和OVA,制备了FFA-EDC-KLH/HSA/OVA和FFA-GA-KLH/HSA/OVA完全抗原,经紫外光谱法鉴定合成成功;氟苯尼考胺连接琥珀酸酐,合成半抗原FFA-HS,经质谱鉴定合成成功,通过DCC法分别与HSA和OVA连接,制备了 FFA-HS-HSA和FFA-HS-OVA,经紫外光谱法鉴定合成成功。2.小鼠血清的筛选:分别将 FF-HS-KLH/HSA、FFA-EDC-KLH/HSA、FFA-GA-KLH/HSA和FFA-HS-HSA免疫雌性Balb/c小鼠,用同源、异源包被原检测抗血清。产生的抗血清结果差异较大,其中FF-HS-KLH/HSA作免疫原、FFA-EDC-OVA作包被原,筛选的抗血清能识别氟苯尼考和甲砜霉素。FFA-EDC-KLH/HSA和FFA-GA-KLH/HSA产生的抗血清,效价都比较高,但是没有特异性;FFA-HS-HSA产生的抗血清效价较低,而且没有特异性。通过单克隆抗体技术进行筛选,获得了两株稳定的杂交瘤细 胞株FF/7A8和TAP/5F4。3.FF/7A8单克隆抗体的制备:FF/7A8细胞株染色体的平均数为102.8。利用小鼠,通过体内诱生法制备了单克隆抗体,经鉴定亚类为IgGi。以FFA-EDC-OVA为包被原、FF为竞争物,优化ELISA条件,建立了间接竞争ELISA方法。结果表明,抗原最佳包被浓度为1 μg/mL,单克隆抗体的最佳稀释度为1:240000;标准曲线回归方程为:y=-0.5116x+0.1488,R2=0.9992,IC50值为 0.21±0.02μg/L(n=5),线性范围为0.05～0.8 μg/L,板内和板间变异系数均小于10%;测定20份0μg/L标准溶液,得出该方法的灵敏度为0.037 μg/L。4.TAP/5F4单克隆抗体的制备:TAP/5F4细胞株染色体的平均数104.5。利用小鼠,通过体内诱生法制备了单克隆抗体,经鉴定亚类为IgG1。以FFA-EDC-OVA为包被原、TAP为竞争物,优化ELISA条件,建立了间接竞争ELISA方法。结果表明,抗原最佳包被浓度为1μg/mL,抗体的最佳稀释度为1:16000;标准曲线回归方程为:y=-0.5434x+0.2504,R2=0.9965,IC50值为 0.35±0.03 μg/L(n=5),线性范围为 0.1～1.6 μg/L,板内和板间变异系数均小于10%;测定20份0μg/L标准溶液,得出该方法的灵敏度为0.065μg/L。该抗体对FF的交叉反应率为167%,对FF和TAP都有较好的特异性。5.组织样品的检测:向猪肉、鸡肉、鱼、猪肝和鸡肝中添加FF标准溶液,浓度分别为0.15、0.3、0.6 μg/kg。样品经乙酸乙酯处理,然后用FF/7A8细胞获得的抗体进行ELISA检测,结果表明药物回收率为78.0%～111.8%,批内和批间变异系数均小于15%,说明该ELISA检测方法有着良好的准确性和重复性。6.组织样品的检测:向猪肉、鸡肉、鱼、猪肝和鸡肝中分别添加FF和TAP,FF 浓度为 0.15、0.3、0.6μg/kg,TAP 浓度为 0.2、0.4、0.8μg/kg。样品经乙酸乙酯处理,然后用TAP/5F4细胞获得的抗体进行ELISA检测,结果表明FF回收率为72.8%～110.5%,批内和批间变异系数均小于15%;TAP回收率为75.3%～113.4%,批内和批间变异系数均小于15%,说明该ELISA检测方法有着良好的准确性和重复性。7.仪器方法的验证:通过鸡喂养实验和液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)对比考核,检测结果表明该ELISA方法和LC-MS/MS方法相关性良好,相关系数为R2=0.9949,表明该ELISA方法检测结果切实可靠。本研究制备了两种单克隆抗体,能够识别氟苯尼考和甲砜霉素,和国内外同类产品相比灵敏度较高;本研究建立了动物可食性组织中FF和TAP提取方法,并应用于ELISA检测,是一种方法简单、快捷的处理手段;本研究建立了一种对FF和TAP高灵敏度和高特异性的ELISA检测方法,具有较高的学术价值和较广阔的应用前景。