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背景:海马神经元树突棘形态/数量异常重塑并形成错误的突触连接,重建神经网络形成具有超激发能力的神经环路,即海马神经元神经网络重建,可能是内侧颞叶癫痫的重要病理机制之一。Cofilin主要影响细胞骨架蛋白动力学,通过切割肌动蛋白F-actin从而调控肌动蛋白纤维解聚与聚合,致使树突棘发生动态改变,参与调节突触可塑性。Cofilin的磷酸化和去磷酸化平衡调控细胞骨架重组,对于癫痫神经元树突棘重塑至关重要。当神经细胞内Ca2+升高可激活CaMKⅡ影响突触重建、神经递质释放等过程,在癫痫的发生发展中有重要作用。因此,积极探讨CaMKⅡ/cofilin/F-actin通路是否通过调控神经元细胞骨架重组介导树突棘重塑对寻找颞叶癫痫的潜在药物研究靶点有着深远的影响。目的:1、观察内侧颞叶癫痫患者手术切除的内侧颞叶与海马脑组织神经网络异常;2、探究颞叶癫痫患者致痫灶脑组织蛋白差异表达谱并验证CaMKⅡ表达情况,寻找颞叶癫痫发生发展的可疑致病蛋白;3、探究CaMKⅡ/cofilin/F-actin通路是否调控海马神经元细胞骨架重组介导树突棘重塑,为癫痫寻找有效的临床治疗策略与潜在的药物研发靶点。方法:1、搜集手术切除的内侧颞叶癫痫患者的前颞叶与海马脑组织（n=6）和无癫痫发作颞叶胶质瘤患者瘤旁正常前颞叶与海马脑组织（n=5）制备人脑组织石蜡切片,进行HE染色、Nissl染色并于光学显微镜下观察组织病理学改变;Neurofilament免疫荧光染色共聚焦显显微镜观察神经纤维形态与排列;Neu N/Doublecortin免疫荧光双染共聚焦显微镜观察神经元细胞成熟度;Tau/MAP2/Synaptophysin免疫荧光三染共聚焦显微镜观察突触重组与神经突起形态;2、对上述脑组织进行4D label free定量蛋白质组学测序寻找差异表达蛋白谱,对差异表蛋白进行蛋白注释、GO二级分类、KEGG通路富集分析、蛋白功能聚类分析、蛋白互作分析,筛选可疑的致病蛋白;进一步,对筛选到的致病蛋白进行人脑组织石蜡切片MAP2/CaMKⅡ免疫荧光双染共聚焦显微镜成像及CaMKⅡ免疫荧光染色STED超高分辨成像,验证其致痫灶脑组织的表达与定位;3、制备大鼠海人酸（Kainic acid,KA）杏仁核点燃癫痫模型,探索癫痫大鼠海马脑组织病理学损伤动态变化与CaMKⅡ蛋白动态表达趋势的相关性。设假手术（Sham）组、KA癫痫模型（KA）组、KA癫痫模型+CaMKⅡ选择性抑制剂KN-93（KA+KN-93）组、KA癫痫模型+KN-93非活性类似物KN-92（KA+KN-92）组,评估各组大鼠癫痫发作行为学评分;检测各组大鼠海马脑组织丙二醛（malonaldehyde,MDA）水平与超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性以评估氧化应激损伤情况,Western Blot检测CaMKⅡ、cofilin、p-cofilin、F-actin蛋白表达水平,Golgi染色观察海马神经元树突的数量与形态,并运用Image J软件计算树突棘密度、成熟树突棘比例;制备大鼠脑组织石蜡切片进行Tau/MAP2/Synaptophysin免疫荧光三染共聚焦显微镜观察癫痫大鼠海马神经元突触重组情况与突起形态。结果:1、HE和Nissl染色结果显示内侧颞叶癫痫患者脑组织海马神经元细胞选择性丢失;神经元不同程度的损伤,部分呈现为损伤性红色神经元;以小胶质细胞为主胶质细胞增生;海马组织结构致密即海马硬化。Neurofilament免疫荧光染色结果显示致痫灶脑组织神经纤维排列紊乱、出芽、缠结;Neu N/Doublecortin免疫荧光双染结果提示致痫灶脑组织不成熟神经元细胞比例升高;Tau/MAP2/Synaptophysin免疫荧光三染结果显示致痫灶脑组织神经元树突、轴突排列异常缠结,突触数量增多且异常蓄积;2、定量蛋白组学研究结果发现,与对照组脑组织相比,致痫灶脑组织有569个蛋白表达上调和841个蛋白表达下调,其中参与轴突引导、谷氨酸能神经元突触、多巴胺能神经元突触、GABA神经元突触、钙离子信号等通路的上调蛋白可能在癫痫的发生发展中发挥重要作用;石蜡切片MAP2/CaMKⅡ免疫荧光双染结果显示致痫灶脑组织CaMKⅡ表达显著增加,且沿树突异常蓄积;3、癫痫大鼠海马脑组织病理损伤于癫痫发作24 h最为严重,且癫痫发作24 h时癫痫大鼠海马脑组织CaMKⅡ蛋白表达显著增加（p＜0.001）;KA组大鼠海马脑组织MDA水平显著增加（p＜0.001）,SOD活性显著下降（p＜0.001）,CaMKⅡ蛋白表达显著上调（p＜0.001）,cofilin表达有所升高（p＜0.05）,p-cofilin表达显著增加（p＜0.01）,p-cofilin/cofilin比值显著增加（p＜0.01）,F-actin表达显著减少（p＜0.001）;Golgi染色结果显示海马神经元树突排列明显紊乱、弯曲、发芽、缠结,树突棘密度下降（p＜0.05）,成熟树突棘比例显著下降（p＜0.01）;Tau/MAP2/Synaptophysin免疫荧光三染结果显示癫痫大鼠海马神经元树突、轴突发生弯曲、发芽、缠结,突触异常重组且蓄积形成的突触斑。与KA组相比,KA+KN-93组大鼠癫痫发作行为学评分明显改善,但急性期癫痫持续状态潜伏期无明显差别;海马脑组织匀浆中MDA水平显著降低（p＜0.01）,SOD活性增加（p＜0.05）;海马脑组织pcofilin表达减少（p＜0.01）,p-cofilin/cofilin比值显著降低（p＜0.001）,F-actin表达增多（p＜0.001）,而对cofilin总蛋白水平无显著影响;Golgi染色结果显示CaMKⅡ活性抑制后海马神经元树突排列明显规律,弯曲、发芽、缠结显著减少,树突棘密度增大（p＜0.05）,成熟树突棘比值显著增加（p＜0.01）;Tau/MAP2/Synaptophysin免疫荧光三染结果显示CaMKⅡ活性抑制后癫痫大鼠海马神经元树突、轴突形态异常明显改善,弯曲、发芽、缠结显著减少,突触异常重组且蓄积形成的突触斑明显减少。结论:1、内侧颞叶癫痫患者前颞叶与海马脑组织神经纤维排列紊乱、出芽、缠结,突触重组,神经网络异常重塑,不成熟神经元比例升高;2、内侧颞叶癫痫患者前颞叶与海马脑组织蛋白组学测序结果表明颞叶癫痫患者致痫灶脑组织蛋白表达明显异常,其中轴突引导、谷氨酸能神经元突触、多巴胺能神经元突触、GABA神经元突触、钙离子信号等通路可能在癫痫的发生发展中发挥重要作用;3、内侧颞叶癫痫患者致痫灶与癫痫大鼠海马脑组织CaMKⅡ表达均明显上调;4、CaMKⅡ/cofilin/F-actin通路调控癫痫大鼠海马神经元肌动蛋白细胞骨架重组介导树突棘重塑与突触重组,导致癫痫大鼠神经网络异常。