白斑综合征病毒(WSSV)是危害全球对虾养殖业最严重的病原体之一,给对虾养殖带来了巨大危害。虽然目前还没有有效地控制该病毒蔓延的方法,但是随着wssv基因组测序的完成,该病毒结构基因的组成与功能越来越清晰,这为研究病毒侵染对虾细胞的机制奠定了基础。在研究病毒侵染对虾机制的过程中,研究者们发现病毒的某些囊膜蛋白在启动病毒感染的发生或介导病毒的侵入方面起着重要作用,其中VP28和VP26就是两种非常重要的病毒囊膜蛋白。越来越多的研究表明将一些重要的病毒囊膜蛋白导入对虾体内后,能够增强对虾抗WSSV侵染的能力,而这一研究结果促进了wssv蛋白质亚单位疫苗的诞生。然而蛋白亚单位疫苗的本质是蛋白质,在通过口服的方式免疫对虾时,由于无法以蛋白质大分子的形式被吸收,而达不到很好的免疫效果,因此需要寻求能够携带大分子货物穿越细胞膜的载体—细胞穿膜肽(CPPs)的帮助。本研究首先利用毕赤酵母表达系统成功表达了CPPs-GFP的融合蛋白,所选用的CPPs分别是TAT、R9和Penetratin,并证明CPPs可以携带蛋白质GFP(绿色荧光蛋白)活体穿过克氏原螯虾的肠系膜进入到虾体的血液循环中,然后到达各个组织。在此基础上,再次利用毕赤酵母表达系统成功分泌性表达了VP28和VP26与CPPs的融合蛋白,为WSSV蛋白质亚单位疫苗规模化生产提供了基础数据。具体研究内容与结果如下：1.TAT-GFP、R9-GFP和Penetratin-GFP融合蛋白在毕赤酵母中成功分泌性表达。首先,提取pTracer-CMV2质粒作为扩增GFP基因的模板,并且根据TAT、 R9和Penetratin的氨基酸序列利用Codon Adaptation Tool软件设计了适合在酵母中表达的核酸序列,通过引物悬挂法将这些核酸序列添加到了GFP基因的5’端。选择表达载体pGAPZαA的EcoRI和XbaⅠ双限制性内切酶酶切位点,因此在目的基因的两端也分别添加了EcoRⅠ和XbaⅠ的核酸序列。然后,将酶切后的目的基因插入到表达载体中,转化TOP10大肠杆菌感受态细胞,经博莱霉素(Zeocin)抗性筛选阳性克隆,通过测序后可知重组表达载体成功构建。其次,重组质粒经限制性内切酶BlnⅠ (AvrⅡ)酶切线性化之后,电击转化毕赤酵母X-33感受态细胞,经Zeocin抗性筛选得到阳性转化子。最后,SDS-PAGE蛋白质电泳检测重组酵母表达上清目的蛋白的表达情况,结果表明本研究成功利用毕赤酵母表达系统表达了GFP、TAT-GFP、R9-GFP和Penetratin-GFP蛋白,分子量大小约在29kDa。2.检测CPPs携带蛋白质分子穿膜的效果。实验室小规模发酵获得GFP、TAT-GFP、R9-GFP和Penetratin-GFP目的蛋白,经冷冻干燥后获得蛋白上清冷冻干粉,接着用PBS配制成10mg/ml的蛋白母液。用克氏原螯虾作为实验动物,活体灌喂等体积等浓度的GFP、TAT-GFP、R9-GFP和Penetratin-GFP的蛋白溶液,同时灌喂等体积的PBS作为阴性对照。灌喂两小时后分别取样鳌虾的中肠、心脏和肌肉组织进行冷冻切片分析,利用荧光倒置显微镜可以观察到,灌喂TAT-GFP、R9-GFP和Penetratin-GFP的蛋白溶液组的鳌虾的肠道、心脏和肌肉可以看到明显的荧光,而灌喂GFP蛋白液的鳌虾仅在肠道中看到微弱的荧光,阴性对照没有观察到任何荧光。3.VP28-TAT/R9、VP26-TAT/R9和GFP-TAT/R9融合蛋白在毕赤酵母中组成型分泌表达。根据Genbank中WSSV的基因序列设计引物,以WSSV粗提液为模板进行普通PCR扩增,得到VP28和VP26基因。同样用引物悬挂法将TAT和R9的核酸序列添加到VP28、VP26和GFP基因的3’端,并且添加EcoRI和XbaI酶切位点。目的基因经过双酶切、与表达载体连接、线性化、转化毕赤酵母和筛选重组酵母这一系列分子克隆操作过程后,成功得到了重组酵母。SDS-PAGE电泳分析毕赤酵母表达上清的目的蛋白,经考马斯亮蓝R-250染色发现GFP-TAT和GFP-R9表达上清有明显条带,蛋白分子量大小在29kDa左右,但是没有检测到VP28-TAT/R9和VP26-TAT/R9重组蛋白的存在。随后,采用更灵敏的蛋白质检测方法—蛋白质银染法,结果发现VP28-TAT/R9和VP26-TAT/R9表达上清组有明显的条带,证明VP28和VP26及其与TAT和R9的融合蛋白在毕赤酵母中成功表达,蛋白分子量大小约为32kDa。