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目的构建表达程序性死亡分子1(Programmed death-1,PD-1)抗体的靶向间皮素嵌合抗原受体修饰T细胞(Chimeric antigen receptor T cell,CAR-T)。从体外和体内角度初步探索表达PD-1抗体的靶向间皮素嵌合抗原受体修饰T细胞对肝外胆管癌和胆囊癌的杀伤作用,为胆道恶性肿瘤提供初步的转基因修饰T细胞治疗新思路。方法1.肝外胆管癌和癌旁肝外胆管配对样本组织9例,18例肝外胆管癌组织,制备成肝外胆管癌组织芯片,共收录27例肝外胆管癌患者标本组织。20例胆囊癌患者的癌和癌旁正常胆囊配对样本组织各1例,60例胆囊癌组织,制备成胆囊癌组织芯片,共收录80例胆囊癌患者标本组织。免疫组化检测癌和癌旁正常组织间皮素的表达和定位。2.人工合成PD1-MesoCAR和MesoCAR基因,制备目的质粒,用电转的方法获得表达PD-1抗体的MesoCAR-T细胞,并通过Western blot,Elisa等方法检测PD-1抗体和MesoCAR在T细胞中的表达。流式细胞术测定活化T淋巴细胞的表面免疫抑制分子PD1,T细胞免疫球蛋白粘蛋白分子3(T cell immunoglobulin domain and mucin domain-3,Tim-3)和淋巴细胞活化基因分子3(Lymphocyte activation gene-3,LAG-3)表达。流式细胞术测PD1-MesoCAR-T/Meso CAR-T/Control-T细胞中CD3+CD8+T细胞和CD3+CD4+T细胞百分比,T细胞活化标记CD137和CD28百分比,以及记忆标记CD62L和CCR7百分比。3.Western blot和流式细胞术检测胆道肿瘤细胞系EH-GB1,EH-GB2,EH-CA1a,EH-CA1b,GBC-SD间皮素的表达,并用实时杀伤检测系统和LDH法检测PD1-MesoCAR-T和MesoCAR-T对各肿瘤细胞系的杀伤作用,并用流式细胞术检测CAR-T细胞与EH-CA1a共培养后细胞因子分泌量。4.构建稳定表达荧光素酶报告基因的EH-CA1a luc肿瘤细胞株,NOD/SCID小鼠皮下EH-CA1a luc肿瘤细胞株成瘤,瘤内注射MesoCAR-T和PD1-MesoCAR-T细胞治疗,并进行小鼠活体成像和肿瘤荧光信号强度的检测。结果1.相对于癌旁组织,(1)肝外胆管癌组织胞浆(3.65±2.98 vs.0.89±0.93)和胞膜(2.69±2.68 vs.0.22±0.67)均有间皮素的阳性表达,差异有统计学意义(P<0.05);(2)肝外胆管癌组织胞浆(47.31%±38.29%vs.6.56%±10.29%),胞膜(22.96%±30.88%vs.0.11%±0.33%),间皮素表达阳性率增高,差异有统计学意义(P<0.05);(3)胆囊癌组织胞浆(2.15±2.73 vs.1.20±1.44),胞膜(1.13±1.26 vs.0.25±0.44)和胞核(0.70±1.25 vs.0.15±0.67)均有间皮素的阳性表达,差异有统计学意义(P<0.05);(4)胆囊癌组织胞浆(30.72%±39.80%vs.10.45%±22.18%)和胞膜(5.72%±11.60%vs.1.10%±2.59%)间皮素表达阳性率增高,差异有统计学意义(P<0.05)。2.流式细胞术检测单链可变区(Single chain variable fragment,scFv)的表达,结果显示PD1-MesoCAR-T细胞和MesoCAR-T细胞的阳性率均在30%左右。Western blot检测外源性CD3ζ链(MesoCAR)的大小约为65kDa,IgG4.Fcγ(PD1抗体)的大小约为55kDa。Elisa法检测PD1抗体的表达量,结果发现Control-T细胞组和MesoCAR-T细胞组几乎无PD1抗体的分泌,PD1-MesoCAR-T细胞组分泌的PD1抗体浓度在400ng/ml左右。相对于Control-T和MesoCAR-T细胞,PD1-MesoCAR-T细胞分泌的PD1抗体有封闭活化T细胞免疫抑制分子Tim3,LAG3和PD1作用。PD1-MesoCAR-T和MesoCAR-T细胞中CD3+CD8+T细胞均在45%左右,CD3+CD4+T细胞均在52%左右,无差异。表达PD1抗体的MesoCAR-T细胞CD137活化标记最强,MesoCAR-T细胞次之,Control-T细胞最弱,活化标记CD28差异不明显(CD137:PD1-MesoCAR-T:MesoCAR-T=22.9%:15.4%,PD1-MesoCAR-T:Control-T=22.9%:6.3%,MesoCAR-T:Control-T=15.4%:6.3%;CD28:PD1-MesoCAR-T:MesoCAR-T=99.0%:98.5%,PD1-MesoCAR-T:Control-T=99.0%:99.0%,Meso-CAR-T:Control-T=98.5%:99.0%)。PD1-Meso CAR-T细胞和MesoCAR-T细胞均能刺激中枢性记忆T细胞以及效应性记忆T细胞的形成,并且PD1-MesoCAR-T细胞和MesoCAR-T细胞之间无明显差异。(CCR7+CD62L+:PD1-MesoCAR-T:MesoCAR-T=15.2%:15.8%,PD1-MesCAR-T:Control-T=15.2%:8.2%,MesoCAR-T:Control-T=15.8%:8.2%;CCR7-CD62L-:PD1-MesoCAR-T:MesoCAR-T=28.5%:26.0%,PD1-MesoCAR-T:Control-T=28.5%:12.6%,MesoCAR-T:Control-T=26.0%:12.6%)。3.胆管癌细胞系EH-CA1a间皮素阳性率约86.9%,EH-CA1b间皮素阳性率约66.2%,胆囊癌细胞系EH-GB1间皮素阳性率约18.2%,EH-GB2间皮素阳性率约18.6%,GBC-SD间皮素阳性率约9.7%。表达PD1抗体的Meso CAR-T细胞对贴壁生长胆道肿瘤细胞系EH-GB1,EH-GB2,EH-CA1b,GBC-SD杀伤作用最强,其次为MesoCAR-T细胞,Control-T杀伤效果最弱。相对于Control-T组,PD1-Meso CAR-T细胞对悬浮生长EH-CA1a细胞系无论是在8:1的效靶比(0.9333±0.0029 vs.0.4041±0.4042)还是在4:1的效靶比(0.8698±0.0219 vs.0.3285±0.2823),细胞杀伤率均较高,差异有统计学意义(P<0.05),MesoCAR-T细胞仅在效靶比为4:1时(0.6825±0.0400 vs.0.3285±0.2823)细胞杀伤率较高,差异有统计学意义(P<0.05)。PD1-MesoCAR-T/MesoCAR-T细胞与EH-CA1a细胞系共培养后胞内细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-r的释放明显高于Control-T细胞组,差异有统计学意义(P<0.05)。相对于Meso CAR-T细胞共培养组,PD1-MesoCAR-T细胞共培养组胞内细胞因子IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α的释放明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。4.第20天,与PBS治疗组荧光信号强度(p/s/cm~2/sr)相比,Control-T(5134800.00±89334.76vs.4789800.00±45806.11),MesoCAR-T(5134800.00±89334.76 vs.4771600.00±50312.03),PD1-MesoCAR-T(5134800.00±89334.76 vs.4766600.00±40997.56)治疗组肿瘤增长缓慢,差异有统计学意义(P<0.05)。第30天,与PBS治疗组肿瘤荧光信号强度(p/s/cm~2/sr)相比,Control-T(9216600.00±225496.79 vs.7371400.00±120885.48),MesoCAR-T(9216600.00±225496.79 vs.4677000.00±50808.46),PD1-MesoCAR-T(9216600.00±225496.79 vs.4632800.00±55074.50)治疗组肿瘤增长缓慢,与Control-T治疗组相比,MesoCAR-T(7371400.00±120885.48 vs.4677000.00±50808.46),PD1-MesoCAR-T(7371400.00±120885.48 vs.4632800.00±55074.50)治疗组肿瘤增长缓慢,差异有统计学意义(P<0.05)。第40天,与PBS治疗组荧光信号强度(p/s/cm~2/sr)相比,Control-T(364260000.00±437331402.00 vs.47675000.00±4721924.04),MesoCAR-T(364260000.00±437331402.00 vs.5899200.00±652853.51),PD1-MesoCAR-T(364260000.00±437331402.00vs.4432200.00±350740.22)治疗组肿瘤增长缓慢,与Control-T治疗组相比,MesoCAR-T(47675000.00±4721924.04 vs.5899200.00±652853.51),PD1-MesoCAR-T(47675000.00±4721924.04 vs.4432200.00±350740.22)治疗组肿瘤增长缓慢,差异有统计学意义(P<0.05)。到第40天,PBS治疗组死亡小鼠3只,Control-T治疗组死亡小鼠1只。到第50天PBS治疗组死亡小鼠4只,Control-T治疗组死亡小鼠3只,Meso CAR-T治疗组死亡小鼠1只。结论1.本组织芯片免疫组化实验研究结果说明相对于肝外胆管癌癌旁组织,间皮素在肝外胆管癌组织中呈高表达,癌细胞胞浆和胞膜中均有差异性表达。相对于胆囊癌癌旁组织,间皮素在胆囊癌组织中呈高表达,癌细胞胞浆,胞膜和胞核中均有差异性表达。对于研究者进一步研究间皮素与胆道恶性肿瘤的发生发展机制及其生物学行为关系提供参考,也为本课题后续实验提供了临床组织学水平研究基础;2.成功构建了表达PD-1抗体的靶向间皮素嵌合抗原受体修饰T细胞,为后续体外、体内研究及其应用于治疗胆道恶性肿瘤的临床试验奠定基础;3.PD1-MesoCAR-T细胞和MesoCAR-T细胞在一定的效靶比前提下对胆道肿瘤细胞胞膜间皮素高表达细胞株均有一定的杀伤能力,并且能促进细胞因子在效应细胞胞内的分泌。对肿瘤细胞胞膜间皮素表达较低的细胞株杀伤效果不明显;4.PD1-MesoCAR-T细胞和MesoCAR-T细胞均对体内间皮素高表达胆管癌细胞株移植瘤有一定的抑制作用。两者间移植瘤的抑制作用暂未发现明显差异,需要弥补本课题的不足,完善研究方案,进一步研究。