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背景: 慢性阻塞性肺疾病(COPD)是世界上最常见的慢性疾病之一,吸烟是其最常见也是最危险的因素。COPD的一个重要合并症是肺血管重塑所致的持续性肺动脉高压。氧化应激与COPD的发展及加重密切相关。大量研究证明,Nrf2在吸烟诱导的抗氧化损伤反应中起关键作用,同时氧化应激与细胞的衰老密切相关,近来研究表明,肺血管重塑与衰老有关。目前关于Nrf2在香烟烟雾提取物(CSE)诱导细胞衰老中的作用的研究报道还很少。 目的: 观察CSE诱导的人肺动脉内皮细胞中Nrf2蛋白及衰老相关蛋白的表达情况,为深入探讨Nrf2在吸烟相关肺动脉高压和肺血管重塑中的作用提供新思路与实验依据。 方法: 采用香烟烟雾提取物(CSE)刺激人肺动脉内皮细胞(HPAEC),用倒置相差显微镜观察细胞形态;CCK-8检测细胞活性;Western blot检测Nrf2及其稳定蛋白DJ-1、下游抗氧化蛋白血红素氧合酶1(HO-1)和醌氧化还原酶(NQO1)、衰老相关蛋白的表达变化;细胞免疫荧光检测Nrf2、P53、P16蛋白表达变化;采用衰老相关β-半乳糖苷酶试剂盒检测细胞β-半乳糖苷酶的表达变化;应用ELISA实验检测细胞因子TNFα、MCP-1、TGF-β1、bFGF、IL-6表达水平的变化。 结果: 1、CSE刺激诱导人肺动脉内皮细胞形态学改变 随着CSE浓度升高和刺激时间延长,HPAEC逐渐伸展扁平、细胞间隙增宽、立体感减弱,细胞质内出现大量颗粒和空泡。 2、CSE刺激诱导人肺动脉内皮细胞的细胞活性变化 随着CSE浓度升高,培养的人肺动脉内皮细胞增殖活性逐渐降低,尤其从1.5%CSE开始明显降低。 3、CSE刺激诱导人肺动脉内皮细胞内多种蛋白质的表达变化 (1)随CSE浓度升高和刺激时间延长,细胞内Nrf2蛋白及其稳定蛋白DJ-1表达先增高后降低。 (2)随CSE浓度升高和刺激时间延长,细胞内Nrf2调控的抗氧化蛋白HO-1、NQO1表达先增高后降低。 (3)随CSE浓度升高和刺激时间延长,衰老相关蛋白P53、P21、P16表达逐渐增高。 4、CSE刺激诱导人肺动脉内皮细胞内β-半乳糖苷酶表达变化 随CSE浓度升高和刺激时间延长,细胞内衰老相关β-半乳糖苷酶表达逐渐增高。 5、CSE刺激诱导人肺动脉内皮细胞细胞因子表达变化 随CSE刺激时间延长,细胞培养基上清内细胞因子TNFα、MCP-1、TGF-β1、bFGF、IL-6表达水平增高。 结论: 1、香烟烟雾提取物能够诱导人肺动脉内皮细胞Nrf2信号通路先活化后抑制。 2、香烟烟雾提取物能够诱导人肺动脉内皮细胞衰老并释放细胞因子。 3、高浓度和长时间香烟烟雾刺激人肺动脉内皮细胞后,可能通过抑制Nrf2诱导细胞衰老,并分泌细胞因子改变细胞微环境,引起肺血管重塑。