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目的通过体外构建嘌呤霉素（PAN)导致小鼠肾小球足细胞（MPC5）损伤的模型，并予他克莫司（FK506）干预，观察8h、24h和48h各组足细胞形态结构、数量和凋亡率的变化，足细胞线粒体膜电位变化程度，PINK1/Parkin通路相关蛋白的表达变化，足细胞自噬体超微结构的变化，探讨 PINK1/Parkin信号通路介导的线粒体自噬在肾小球足细胞损伤中的作用机制，从而为缓解蛋白尿、防止慢性肾脏病进一步进展提供新的治疗靶点。
方法将体外培养肾小球足细胞（MPC5）分为三组，即对照组、PAN组和FK506组。实验进行前，三组细胞用不含血清纯RPMI1640培养12小时，随后换含有0.02%DMSO的RPMI1640培养液，其中对照组不加PAN和FK506， PAN组加入终浓度为50ug/ml的PAN，FK506组先予5ug/ml的FK506孵育1h，随后更换终浓度为50ug/ml PAN和5ug/ml FK506的0.02%DMSO的RPMI1640培养液。在药物作用后的8h，24h和48h，应用倒置显微镜观察各组足细胞的形态变化并摄像记录，应用图像处理软件分析各组细胞的面积变化；采用流式细胞仪检测和分析足细胞的凋亡率、线粒体膜电位变化；采用实时荧光定量 PCR检测PINK1、Parkin、LC3基因mRNA的表达变化，通过Western blot检测足细胞PINK1/Parkin通路相关蛋白以及自噬相关蛋白 LC3-II的表达程度；应用透射电镜检测肾小球足细胞内线粒体形态、结构以及各组自噬体表达的程度。
结果①对照组在8h、24h和48h，肾小球足细胞足细胞形态清晰，胞体未见明显缩小，足突完整，未见减少和回缩，细胞与细胞之间的连接很紧密，贴壁良好，培养液中可见极少量漂浮的死细胞。PAN组在给予 PAN8h、24h和48h后，足细胞的胞体较对照组的显著缩小（p＜0.05），足细胞胞体不饱满，明显缩小，足突回缩、变少，甚至消失，细胞质变少，细胞核出现核固缩，细胞与细胞的连接非常松散。相比同时间段PAN组，FK506组8h、24h和48h后，足细胞形态胞体较PAN组的大，足细胞的形态、大小也近似正常，足突较PAN组的多，且明显，差异具有统计学意义（p＜0.05），与对照组相比差异无统计学意义。②应用Annexin V-FITC/Propidium Iodide(PI)双染足细胞，采用流式细胞仪检测对各组足细胞的凋亡率，经过8h、24h和48h后，可见对照组足细胞的凋亡率有所上升，但处于较低水平，PAN组足细胞凋亡率随时间的增长而升高，比相同时间段对照组足细胞凋亡率升高，且差异具有统计学意义（p＜0.05）。同一观察时间点，FK506组足细胞的凋亡率较PAN组的明显降低，差异有显著性（p＜0.05）。应用JC-1染色法，通过流式细胞仪检测线粒体膜电位变化，8h、24h和48h后，对照组和FK506组线粒体JC-1单聚体稍有增多，而PAN组随时间的递增，JC-1单聚体明显增多，表明 PAN组线粒体膜电位去极化程度增加，功能障碍的线粒体增多，与相同时间点对照组、FK506组的相比，差异有统计学意义（p＜0.05），对照组与FK506组JC-1单聚体数量的差异无统计学意义(p＞0.05)。③Real-time PCR结果表明,对照组在8h、24h和48h时，足细胞内PINK1、Parkin基因mRNA表达量未见明显增加（p＞0.05）。PAN组随PAN损伤时间延长，PINK1、Parkin基因表达量mRNA表达逐渐增强，48h为表达的最高水平(p＜0.05), FK506组和对照组PINK1和Parkin mRNA表达随时间的延长而略有增多，但较PAN组的表达量少，对照组与PAN组，FK506组与PAN组比较有统计学意义(p＜0.05)，对照组与FK506组PINK1和Parkin mRNA表达量比较，差异无统计学意义(p＞0.05)。④Western blotting检测8h、24h和48H各组足细胞PINK1、Parkin、LC3-Ⅱ蛋白表达情况，PAN组PINK1/Parkin信号通路相关蛋白PINK1、Parkin和自噬相关蛋白 LC3-Ⅱ随时间延长，其表达量逐渐增加，较对照组升高，且差异有统计学意义(p＜0.05)；FK506组各蛋白表达量趋于稳定，较PAN组降低，两组比较有统计学意义(p＜0.05)。⑤采用透射电镜观察线粒体形态、结构，线粒体自噬体数量变化，8h、24h和48h各时间点对照组线粒体形态结构完整，大小正常，线粒体嵴排列整齐有序，极少见到孤立双层或者多层膜包裹结构的线粒体自噬体，线粒体自噬体的表达很微弱。PAN组可见随时间的延长，足细胞细胞质成分逐渐减少，出现核固缩、核边集。线粒体逐渐发生肿胀，变圆，线粒体嵴排列紊乱，出现空泡，线粒体自噬体的数量明显增加，到48h时，出现大量溶酶体，可见较多溶酶体与自噬体结合形成自噬溶酶体，线粒体自噬体表达量较对照组明显增强，两组比较，差异有统计学意义（p＜0.05）。FK506组各时间点足细胞和线粒体形态较PAN组完整、清晰，线粒体自噬体表达量比PAN组明显减少，线粒体自噬体的表达趋于稳定，两组比较，差异有统计学意义（p＜0.05），FK506组线粒体自噬体表达量较对照组的稍升高，在4h时间点，两组比较，差异有统计学意义（p＜0.05）。
结论① PAN能诱导足细胞线粒体膜电位去极化，造成线粒体功能障碍，导致足细胞发生凋亡，PAN能使足细胞PINK1/Parkin信号通路介导的线粒体自噬激活，参与足细胞损伤过程。②FK506能减轻PAN导致的足细胞线粒体功能障碍，稳定PINK1/Parkin信号途径介导的线粒体自噬，延缓足细胞进一步损伤。③线粒体自噬对维持足细胞结构和功能有重要作用，调控 PINK1/Parkin信号途径介导的线粒体自噬，有可能为保护足细胞、减轻蛋白尿提供新的治疗靶点。
方法将体外培养肾小球足细胞（MPC5）分为三组，即对照组、PAN组和FK506组。实验进行前，三组细胞用不含血清纯RPMI1640培养12小时，随后换含有0.02%DMSO的RPMI1640培养液，其中对照组不加PAN和FK506， PAN组加入终浓度为50ug/ml的PAN，FK506组先予5ug/ml的FK506孵育1h，随后更换终浓度为50ug/ml PAN和5ug/ml FK506的0.02%DMSO的RPMI1640培养液。在药物作用后的8h，24h和48h，应用倒置显微镜观察各组足细胞的形态变化并摄像记录，应用图像处理软件分析各组细胞的面积变化；采用流式细胞仪检测和分析足细胞的凋亡率、线粒体膜电位变化；采用实时荧光定量 PCR检测PINK1、Parkin、LC3基因mRNA的表达变化，通过Western blot检测足细胞PINK1/Parkin通路相关蛋白以及自噬相关蛋白 LC3-II的表达程度；应用透射电镜检测肾小球足细胞内线粒体形态、结构以及各组自噬体表达的程度。
结果①对照组在8h、24h和48h，肾小球足细胞足细胞形态清晰，胞体未见明显缩小，足突完整，未见减少和回缩，细胞与细胞之间的连接很紧密，贴壁良好，培养液中可见极少量漂浮的死细胞。PAN组在给予 PAN8h、24h和48h后，足细胞的胞体较对照组的显著缩小（p＜0.05），足细胞胞体不饱满，明显缩小，足突回缩、变少，甚至消失，细胞质变少，细胞核出现核固缩，细胞与细胞的连接非常松散。相比同时间段PAN组，FK506组8h、24h和48h后，足细胞形态胞体较PAN组的大，足细胞的形态、大小也近似正常，足突较PAN组的多，且明显，差异具有统计学意义（p＜0.05），与对照组相比差异无统计学意义。②应用Annexin V-FITC/Propidium Iodide(PI)双染足细胞，采用流式细胞仪检测对各组足细胞的凋亡率，经过8h、24h和48h后，可见对照组足细胞的凋亡率有所上升，但处于较低水平，PAN组足细胞凋亡率随时间的增长而升高，比相同时间段对照组足细胞凋亡率升高，且差异具有统计学意义（p＜0.05）。同一观察时间点，FK506组足细胞的凋亡率较PAN组的明显降低，差异有显著性（p＜0.05）。应用JC-1染色法，通过流式细胞仪检测线粒体膜电位变化，8h、24h和48h后，对照组和FK506组线粒体JC-1单聚体稍有增多，而PAN组随时间的递增，JC-1单聚体明显增多，表明 PAN组线粒体膜电位去极化程度增加，功能障碍的线粒体增多，与相同时间点对照组、FK506组的相比，差异有统计学意义（p＜0.05），对照组与FK506组JC-1单聚体数量的差异无统计学意义(p＞0.05)。③Real-time PCR结果表明,对照组在8h、24h和48h时，足细胞内PINK1、Parkin基因mRNA表达量未见明显增加（p＞0.05）。PAN组随PAN损伤时间延长，PINK1、Parkin基因表达量mRNA表达逐渐增强，48h为表达的最高水平(p＜0.05), FK506组和对照组PINK1和Parkin mRNA表达随时间的延长而略有增多，但较PAN组的表达量少，对照组与PAN组，FK506组与PAN组比较有统计学意义(p＜0.05)，对照组与FK506组PINK1和Parkin mRNA表达量比较，差异无统计学意义(p＞0.05)。④Western blotting检测8h、24h和48H各组足细胞PINK1、Parkin、LC3-Ⅱ蛋白表达情况，PAN组PINK1/Parkin信号通路相关蛋白PINK1、Parkin和自噬相关蛋白 LC3-Ⅱ随时间延长，其表达量逐渐增加，较对照组升高，且差异有统计学意义(p＜0.05)；FK506组各蛋白表达量趋于稳定，较PAN组降低，两组比较有统计学意义(p＜0.05)。⑤采用透射电镜观察线粒体形态、结构，线粒体自噬体数量变化，8h、24h和48h各时间点对照组线粒体形态结构完整，大小正常，线粒体嵴排列整齐有序，极少见到孤立双层或者多层膜包裹结构的线粒体自噬体，线粒体自噬体的表达很微弱。PAN组可见随时间的延长，足细胞细胞质成分逐渐减少，出现核固缩、核边集。线粒体逐渐发生肿胀，变圆，线粒体嵴排列紊乱，出现空泡，线粒体自噬体的数量明显增加，到48h时，出现大量溶酶体，可见较多溶酶体与自噬体结合形成自噬溶酶体，线粒体自噬体表达量较对照组明显增强，两组比较，差异有统计学意义（p＜0.05）。FK506组各时间点足细胞和线粒体形态较PAN组完整、清晰，线粒体自噬体表达量比PAN组明显减少，线粒体自噬体的表达趋于稳定，两组比较，差异有统计学意义（p＜0.05），FK506组线粒体自噬体表达量较对照组的稍升高，在4h时间点，两组比较，差异有统计学意义（p＜0.05）。
结论① PAN能诱导足细胞线粒体膜电位去极化，造成线粒体功能障碍，导致足细胞发生凋亡，PAN能使足细胞PINK1/Parkin信号通路介导的线粒体自噬激活，参与足细胞损伤过程。②FK506能减轻PAN导致的足细胞线粒体功能障碍，稳定PINK1/Parkin信号途径介导的线粒体自噬，延缓足细胞进一步损伤。③线粒体自噬对维持足细胞结构和功能有重要作用，调控 PINK1/Parkin信号途径介导的线粒体自噬，有可能为保护足细胞、减轻蛋白尿提供新的治疗靶点。