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鼻咽癌在头颈部恶性肿瘤中的发病率居首位,而广东省是鼻咽癌的高发区。放射治疗作为目前对鼻咽癌最有效的治疗手段,但放射线的无选择性对机体正常组织造成较大的毒副作用、且产生诸多的临床并发症以及放疗后复发;要求我们提出更好的治疗手段来解除病人的痛苦。作为生长迅速的实体肿瘤,鼻咽癌生长到一定体积时,癌细胞常常处于缺氧微环境,为了维持肿瘤持续生长,必须依赖新生血管形成(angiogenesis),因此,肿瘤细胞对缺氧的适应和血管生成是肿瘤发展过程中的关键步骤,且与肿瘤的生长和扩散密切相关。在此过程中缺氧诱导因子-1α(Hyp- oxia inducible factor-1α,HIF-1α)起到中枢纽带作用;HIF-1α是调节肿瘤细胞缺氧反应的主要转录因子,其在许多肿瘤中高表达,且与肿瘤高度侵袭性、易转移、对放化疗不敏感和预后不良密切相关。血管内皮生长因子(vascular endothelial gr- owth factor,VEGF)是血管内皮细胞的特异性有丝分裂原,对血管形成具有重要作用;同时,VEGF的活性亦受到多种因素的调控;近年来的研究发现,VEGF在缺氧组织中的转录活化主要受缺氧诱导因子-l调节,并保持其mRNA的稳定性。RNA干扰是近年来研究基因功能的一个强有力的武器,随着RNA干扰技术在哺乳动物应用研究的深入,利用RNA干扰技术开展基因治疗为肿瘤的治疗提供了新的途径。本研究以鼻咽癌细胞系CNE-Ⅱ为研究对象,通过体外模拟缺氧微环境,以RNA干扰为手段,采用脂质体介导的转染方法,研究HIF-lα小片段干扰性RNA(small interference RNA,siRNA)对缺氧诱导的CNE-Ⅱ细胞转染前后低氧条件下HIF-1α和VEGF的表达,初步探讨HIF-1α在缺氧条件下对鼻咽癌血管生成的调控作用。目的:本研究以鼻咽癌细胞系CNE-Ⅱ为研究对象,通过体外模拟缺氧微环境,以RNA干扰为手段,采用脂质体介导的转染方法,研究HIF-lα小片段干扰性RNA(small inter- ference RNA,siRNA)对缺氧诱导的CNE-Ⅱ细胞转染前后低氧条件下HIF-1α和VEGF的表达,初步探讨HIF-1α在缺氧条件下对鼻咽癌血管生成的调控作用。方法:1. HIF-1αsiRNA制备:设计并合成siRNA(siRNA+阴性对照),并在GenBank database进行BLAST检索作同源性分析。2. CNE-Ⅱ细胞的培养CNE-Ⅱ细胞采用含10 %胎牛血清的RPMI-1640培养基培养,细胞至37℃、5% CO2培养箱内培养,取生长状态良好的细胞用于实验。在培养基中加入浓度为100μmol/L的CoCl2用于模拟肿瘤内部乏氧微环境。3.转染目的细胞:利用阳离子脂质体LipofectamineTM 2000将合成的HIF-1αsiRNA转入鼻咽癌细胞CNE-Ⅱ内。4.因素检测:⑴样品处理:TRIZOL试剂盒提取细胞的总RNA;RIPA裂解液裂解细胞提取总蛋白。⑵RT-PCR:总RNA经逆转录获取其cDNA,根据文献报道合成特异性引物,以半定量PCR克隆检测CNE-Ⅱ中HIF-1α及VEGF在RNA水平上的表达情况。⑶Western blot:蛋白样品的制备,蛋白的定量,SDS-PAG电泳,转膜,免疫反应,化学发光、显影、定影。结果:1.常氧条件下,CNE-Ⅱ细胞HIF-1αmRNA表达水平稳定,VEGFmRNA表达下调,HIF-1α和VEGF蛋白的表达明显下调。2.低氧条件下, CNE-Ⅱ细胞HIF-1αmRNA表达水平稳定,蛋白表达显著升高,而VEGFmRNA和蛋白的表达均显著升高。3.siRNA转染CNE-Ⅱ后能够显著下调HIF-1α的基因表达,同时VEGF基因的表达也受到明显抑制。结论:1.缺氧促使CNE-Ⅱ细胞HIF-1α在蛋白水平表达升高,并通过转录激活VEGF的机制调控鼻咽癌血管生成。2.合成的siRNA通过转染CNE-Ⅱ细胞成功地下调HIF-1α及其下游基因VEGF的表达,从而为进一步研究鼻咽癌的靶向基因治疗奠定了基础。