达托霉素是从玫瑰孢链霉菌发酵液中分离的一种具有环脂肽结构的新型抗生素,结构新颖,作用机制特殊,对革兰氏阳性菌有较好的抑菌效果。其独特的环脂肽结构及作用机制,使其将不会受到来自其它抗生素所致交叉耐药性的影响,具有广阔的市场前景。达托霉素属于微生物次级代谢产物,其生物合成基因是以“基因簇”的形式存在的,全长128kb,经细胞非核糖体途径合成。非核糖体途径的肽合成不依赖mRNA为模板,也不以tRNA为载体,而是通过非核糖体肽链合成酶(NRPSs)识别特定的氨基酸并连接成多肽。目前,达托霉素的制备方法主要有天然发酵法、前体诱导法、化学合成、酶法半合成等,由于达托霉素特有的环脂肽结构,并且含有特殊氨基酸成分,因而微生物发酵生产达托霉素还是目前较为常用的方法。但是此方法的达托霉素表达量较低,无法满足产业化需求,对该生产菌进行改造,提高达托霉素表达水平是很有必要的。此外,合成生物学的飞速发展对抗生素的筛选、改造和制备提供了全新的思路。合成生物学以系统化设计和工程化构建为理念,旨在对多种天然的或人工设计的生物学元件进行合理而系统的组合以获得重构的或非天然的“生物系统”。目前达托霉素生物合成途径及相关功能基因已经被成功解析,应用合成生物学技术可以对其生物合成基因簇进行人为的遗传操作,如通过基因替换筛选新型抗生素、通过更改宿主提高表达量等等。但目前国内合成生物学研究还属于起步阶段,尚无对超大DNA片段,尤其是来源于链霉菌的大片段DNA进行遗传操作的成功报道。为了掌握合成生物学的关键技术体系,尤其是大片段基因的操作技术,为后续的达托霉素合成生物学研究奠定基础,本研究一方面通过对达托霉素原始生产菌(ATCC31568)进行紫外诱变结合抗生素抗性筛选处理,初步提高达原始生产菌的生产能力,并建立系统的发酵培养、分离纯化、分离检测技术。同时通过构建达托霉素生产茵----玫瑰孢链霉菌基因组BAC文库,筛选达托霉素合成基因簇,利用接合转移的方法,实现达托霉素在变铅青链霉菌中的表达,以掌握大片段基因操作技术。本论文利用大肠杆菌-链霉菌穿梭型pESPBAC质粒构建了包含24块96孔板共2304个克隆组成的玫瑰孢链霉菌基因组BAC文库,插入片段大于140kb。利用达托霉素合成基因簇特异性引物进行PCR筛选,成功筛选到含有完整达托霉素合成基因簇的BAC质粒,命名为pESPBAC-DAP。并利用其在大肠杆菌和链霉菌之间的可穿梭性,将pESPBAC-DAP质粒先电转入E.coli ET12567(pUZ8002)中,利用大肠杆菌和链霉菌的接合转移作用,在辅助质粒pUZ8002的辅助下,将达托霉素合成基因簇转移至变铅青链霉菌TK24中,由于pESPBAC载体上存在噬菌体基因组attP位点,在链霉菌噬菌体φC31的整合酶int作用下,与链霉菌基因组中的attB位点发生位点特异性重组,将达托霉素合成基因簇整合到变铅青链霉菌TK24基因组中。对整合后的变铅青链霉菌TK24进行发酵,利用HPLC检测到达托霉素的表达,表达量为30.2mg/L,并对其活性进行检测。通过紫外诱变加大出发菌株突变率的同时,使用利福平(Rifampicin)和庆大霉素(Gentamicin)进行抗性筛选,进一步改良菌株,增加了菌株的抗性标记,快速、有效地提高了菌株的生产能力。筛选到的突变株Ge-27最高产量达到79.44mg/L,比原始菌株提高了42.2%,与原始菌株相比,Ge-27发酵单位有明显提高。说明采用紫外诱变结合抗生素抗性筛选可以高效提升达托霉素生产水平；通过对达托霉素部分ORFs进行实时定量PCR分析后,初步筛选到ORF-12、ORF-53、ORF-21、ORF-31和ORF-22这五个ORF在其生物合成过程中发挥调控作用,其中ORF-12、ORF-21和ORF-53这三个ORFs在达托霉素合成过程中的初始阶段有可能起到限速作用；ORF-31能在达托霉素后期合成过程中起到正调控作用；ORF-22在达托霉素生物合成过程中可能起到负调控的作用,为下一步对单个ORF的功能分析,或者对某一ORF进行敲除或者过表达以提高达托霉素生产水平奠定基础。