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前列腺癌是临床常见的男性恶性肿瘤之一,其发生发展与患者年龄以及雄激素水平密切相关,随着我国人民生活质量水平不断提高,人民平均寿命延长,我国前列腺癌的发病率呈现持续增长趋势。前列腺癌患者易发生转移与复发,这也是导致患者死亡的主要原因。因此探寻前列腺癌转移相关机制,对于前列腺癌的防治具有重要意义。非肌细胞肌球蛋白Ⅱ(Nonmuscle MyosinⅡ,NMⅡ)由两条重链(Nonmuscle myosin heavy chain,NMHC)、两条基本轻链(Essential Light Chain,ELC)和两条调节轻链(Regulatory Light Chain,RLC)组成。NMHC能够与肌动蛋白结合,通过自身磷酸化直接调控细胞运动。人类NMHCⅡ包括三种亚型,分别为NMHCⅡA、NMHCⅡB以及NMHCⅡC。NMHCⅡA由MYH9基因编码,在机体的免疫应答、细胞的迁移、黏附及肿瘤转移等病理生理过程中发挥重要作用。然而在前列腺癌中,NMHCⅡA是否能够影响癌细胞转移目前并不清楚。长非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是一类长度超过200单位核苷酸的非编码RNA,主要通过表观遗传调控、转录调控、转录后调控、miRNA调控等在多种疾病,特别是在肿瘤的侵袭转移中发挥关键作用。有研究报道,LncRNA-HULC通过海绵吸附miR-9-5p,调控miR-9-5p/MYH9轴而促进胃癌进展。在甲状腺乳头状癌中,NMHCⅡA通过与LncRNA-PTCSC2相结合,抑制FOXE1和PTCSC2共有的启动子,从而抑制p53通路并促进癌症的进展。但前列腺癌中,lncRNA与NMHCⅡA之间是否存在调控作用尚不清楚。因此我们试图探索在前列腺癌中,是否存在lncRNA能够调控NMHCⅡA,进而影响前列腺癌的转移。研究目的:研究NMHCⅡA在前列腺癌转移中的作用并筛选前列腺癌中与NMHCⅡA相关的LncRNA调控轴。研究方法:1.使用Oncomine数据库(http://www.Oncomine.org)分析前列腺癌中NMHCⅡA编码基因MYH9的mRNA表达水平。通过western bolt检测良性前列腺增生细胞系BPH-1、前列腺癌细胞系PC3及前列腺癌细胞系PC3高转移型亚细胞系PC3M中NMHCⅡA的蛋白表达水平。2.通过沉默PC3M细胞的NMHCⅡA,筛选稳定感染细胞株,使用western bolt及细胞免疫荧光染色鉴定沉默效果。3.通过体外细胞实验研究沉默NMHCⅡA对细胞PC3M的生物学行为影响,CCK-8检测法测定细胞增殖能力,Transwell迁移和侵袭实验分别检测细胞迁移能力和侵袭能力。4.R语言筛选肿瘤基因图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库中前列腺癌患者转录组数据,得到在前列腺癌患者中异常表达的lncRNA、miRNA,并对二者配对。miRcode、miRDB、Targetscan数据库在线预测靶向MYH9的miRNA,比对在线预测结果与TCGA数据库筛选结果,得到共有的miRNA,并根据lncRNA与miRNA配对结果明确miRNA上游的lncRNA,进而推测lncRNA/miRNA/MYH9调控轴。研究结果:1.NMHCⅡA在前列腺癌中的表达1.1 Oncomine数据库分析显示,共有452项满足筛选条件的独立研究涉及MYH9在不同类型肿瘤与正常组织间的表达情况比较,其中49项研究显示MYH9表达在肿瘤与正常组织间存在统计学差异(P<0.01)。在‘Wallace Prostate’数据集中,MYH9在前列腺癌组织中的表达高于正常前列腺组织(P=2.29E-4)1.2 western bolt结果显示,与前列腺增生细胞系BPH-1相比,NMHCⅡA在前列腺癌细胞系PC3以及PC3高转移亚细胞系PC3M中表达增高(P<0.05);与PC3细胞相比,NMHCⅡA在PC3M细胞中的表达显著增高(P<0.05)。2.荧光显微镜观察,慢病毒感染效率达80%以上。Western bolt与细胞免疫荧光染色结果均显示,NMHCⅡA表达水平在无感染组和空载组之间无明显差异(P>0.05);沉默NMHCⅡA的shMYH9感染组细胞的NMHCⅡA表达水平显著低于无感染组和空载组(P<0.05)。3.沉默NMHCⅡA对前列腺癌细胞PC3M生物学行为的影响3.1 CCK-8试剂盒检测结果显示,空载组与无感染组细胞的增殖能力无明显差异(P>0.05),沉默NMHCⅡA的shMYH9感染组细胞增殖能力显著低于无感染组和空载组(P<0.05)。3.2 Transwell迁移实验显示,空载组与无感染组穿过人工基底膜的细胞无明显差异(P>0.05),沉默NMHCⅡA的shMYH9感染组迁移穿过人工基底膜的细胞明显少于空载组与无感染组(P<0.05)。3.3 Transwell侵袭实验发现,空载组与无感染组降解Matrigel胶穿过基底膜的细胞数无显著差异(P>0.05),沉默NMHCⅡA的shMYH9感染组穿过基底膜细胞的数目显著少于空载组与无感染组(P<0.05)。4.TCGA数据库筛选及miRcode、miRDB、Targetscan公开数据库在线预测结果显示,KIAA0087/mir-133b/MYH9,HNF1A-AS1/mir-133b/MYH9,CACNA1C-IT3/mir-133b/MYH9轴可能在前列腺癌中发挥调节NMHCⅡA的作用。结论:1.NMHCⅡA高表达可能与前列腺癌转移有关。2.NMHCⅡA可能通过调控前列腺癌细胞的迁移、侵袭和增殖能力,从而调节前列腺癌的转移。3.前列腺癌中,LncRNA可能通过KIAA0087/mir-133b/MYH9,HNF1A-AS1/mir-133b/MYH9,CACNA1C-IT3/mir-133b/MYH9,3条潜在调控轴调控NMHCⅡA。