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1.研究背景AOPP是Witko-Sarsat等于1996年首次在慢性肾衰竭(CRF)病人血浆中发现的与尿毒症有关的毒素分子,是中性粒细胞髓过氧化物酶(MPO)催化活性氧生成的次氯酸(HClO)作用于蛋白质而形成含有双酪氨酸的蛋白质氧化交联产物。血浆AOPP水平与双酪氨酸、戊糖素、新喋呤等氧化应激标志物呈正相关,与谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)等抗氧化剂呈负相关,因此AOPP被认为是反映慢性肾衰竭时氧化应激的标志物。其作为氧化应激新的标志物并间接反映着体内氧化应激状态水平,是有一定生物学活性的促炎症反应介质和尿毒症毒素分子,参与慢性肾脏病(chronic kidney disease, CKD)和透析患者临床一些并发症发生的病理生理过程。AOPP在体内外均可激发单核细胞的呼吸爆发,刺激单核细胞合成、释放大量促炎性细胞因子如IL-1β、IL-6和TNF-a等,促发细胞炎症效应,并同时激发中性粒细胞的呼吸爆发,导致更强的氧化应激,正反馈增加自身的形成并增强对单核细胞的效应,进而造成全身微炎症状态。已经证实,AOPP是一种促炎症和促氧化应激介质,单核／巨噬细胞作为体内炎症细胞因子和氧化剂的主要来源是它选择性作用的靶细胞。尿毒清颗粒是南方医院研制的抗肾衰产品,能有效减轻CRF病人的临床症状,改善肾功能,延缓肾功能减退。复方黄甘颗粒是尿毒清颗粒的第二代产品,本实验室前期的动物体内实验表明,复方黄甘提取物能显著性地降低CRF大鼠循环中氧化物质AOPP的含量,减轻CRF大鼠的氧化应激反应,但其具体的作用机制尚需进一步探讨。丹皮酚(Paeonol, Pae)又称牡丹酚,是中药材毛莨科植物牡丹(Paeonia Suffruicosa Andr)根皮和萝摩科植物徐长卿[Pycnostelma Paniculatum(Bunge) K. Schum]干燥根或全草的主要有效成分。大量研究表明,丹皮酚具有抗炎、抗变态反应、免疫调节等作用,对脾脏、胸腺等免疫器官及淋巴细胞、单核细胞等免疫分子均具有明显的免疫调节作用,同时具有抗氧化、抗菌抗肿瘤、保护心血管、镇静催眠及解热镇痛等广泛的药理作用。但其是否会影响巨噬细胞的免疫调节还不太清楚。本次实验旨在通过体外人工合成AOPP,刺激THP-1巨噬细胞后,用于研究复方黄甘提取物及丹皮酚对其氧化应激损伤的影响及其可能的机制。2.研究方法2.1无内毒素AOPP修饰蛋白的制备与鉴定将无内毒素的牛血清白蛋白(BSA)与次氯酸钠(NaCIO)以1/70、1/140、1/280的摩尔比例混合均匀,室温反应30min,制备出三种不同修饰程度的AOPP。按照Witko-Sarsat等的紫外分光光度计法,于酸性条件下,340nm测定AOPP对氯胺-T的相对浓度(μM); Bradford法于595nm处测定AOPP制品和对照BSA样品中总蛋白的含量(mg/ml);凝胶法鲎试剂(灵敏度0.25EU/ml)定性检测AOPP制品中内毒素的含量。2.2复方黄甘提取物及丹皮酚对AOPP诱导THP-1巨噬细胞氧化应激损伤的影响2.2.1THP-1巨噬细胞的诱导分化以160nM的不含血清的PMA溶液刺激人THP-1单核细胞株24h后使之转化成THP-1巨噬细胞。2.2.2复方黄甘提取物及丹皮酚对THP-1巨噬细胞活力的影响用MTT还原法测定细胞活性。不同修饰程度不同浓度的AOPP与细胞共同培养24h后,于多功能酶标仪570nm处测定细胞活力。AOPP预处理巨噬细胞24h,弃去培养上清,再用复方黄甘提取物及丹皮酚继续培养24h,测定细胞活力。2.2.3复方黄甘提取物及丹皮酚对AOPP诱导的THP-1巨噬细胞NO产生的影响不同修饰程度不同浓度的AOPP与THP-1巨噬细胞共同孵育24h,收集上清,用Griess试剂法测定培养上清亚硝酸盐的含量,间接反映NO的产生量。AOPP与巨噬细胞共同培养24h,复方黄甘提取物和丹皮酚分别干预处理24h,用Griess试剂法测定培养上清NO浓度。荧光定量PCR测定iNOS的基因表达。2.2.4复方黄甘提取物及丹皮酚对AOPP诱导的THP-1巨噬细胞ROS、炎性因子产生的影响不同修饰程度不同浓度的AOPP与THP-1巨噬细胞共同孵育24h,培养结束后用对ROS敏感的荧光探针DCFH-DA标记细胞,用多功能酶标仪在λex=485nm、λem=535nm下测定细胞经不同刺激后细胞内氧化DCFH产生的荧光量,即细胞内ROS的产生量。复方黄甘提取物和丹皮酚分别预处理0.5h、1h和2h,AOPP与巨噬细胞继续培养24h;在阻断实验中,细胞分别与自由基清除剂NAC, NADPH抑制剂apocynin、DPI,NF-кB抑制剂PDTC等37℃避光孵育0.5h、1h和2h后再用AOPP刺激24h,培养结束后测定细胞内ROS的产生量。培养上清用ELISA法测定TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白分泌量；荧光定量PCR测定TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1的基因表达水平。2.2.5抑制剂PDTC对AOPP诱导的THP-1巨噬细胞的iNOS表达的影响用AOPP预处理巨噬细胞24h,然后弃去培养上清,再用含PDTC (10μM)的RPMI1640培养基与细胞共同培养24h,荧光定量PCR测定iNOS mRNA的表达。2.2.6丹皮酚对AOPP诱导的THP-1巨噬细胞RAGE受体及清道夫受体CD36、 SR-A、SR-B1的影响用AOPP预处理巨噬细胞24h,然后弃去培养上清,再用含丹皮酚的RPMI1640培养基与细胞共同培养24h,荧光定量PCR测定RAGE、CD36、SR-A和SR-B1受体的表达情况。3.研究结果3.1AOPP的鉴定按照Witko-Sarsat法制备的1/70,1/140,1/280三种修饰程度的AOPP浓度分别为168.5μM、1047.8μM、2340.6μM,远远高于未修饰的BSA的0.58μM。且所有AOPP制备品经凝胶法鲎试剂法测定内毒素含量均低于0.25EU/ml。3.2复方黄甘提取物及丹皮酚对AOPP诱导THP-1巨噬细胞氧化应激损伤的影响3.2.1复方黄甘提取物及丹皮酚对THP-1巨噬细胞活力的影响不同修饰程度不同浓度的AOPP和两种药物与细胞分别培养24h, MTT法测定细胞活力,结果显示,与对照组相比,其对细胞活力无显著性影响。3.2.2AOPP修饰对THP-1巨噬细胞NO产生的影响未经HClO氧化修饰的BSA诱导产生NO的量与空白组相比显著性升高。低浓度HClO氧化修饰产生的AOPP (1/70)也能显著性升高THP-1巨噬细胞产生NO的量,高浓度HClO氧化修饰产生的AOPP(1/140和1/280)则完全丧失了诱导THP-1巨噬细胞产生NO的能力。但AOPP (1/140)的浓度达到200μg/ml时,能显著性地抑制THP-1巨噬细胞NO的产生,抑制程度随AOPP浓度的增加而升高。3.2.3复方黄甘提取物及丹皮酚对AOPP诱导的THP-1巨噬细胞NO产生的影响复方黄甘提取物浓度在100-400μg/ml范围内,显著性逆转AOPP对THP-1巨噬细胞NO产生的影响,且产生NO的量随复方黄甘提取物浓度的增加而增加。丹皮酚浓度在100-400μM范围内,也能显著性增加AOPP对THP-1巨噬细胞NO产生的影响,时间效应显示,其诱导产生的NO的量随培养时间的延长而增加。3.2.4AOPP修饰对THP-1巨噬细胞ROS产生的影响未经HClO氧化修饰的BSA不能诱导THP-1巨噬细胞产生ROS。AOPP氧化修饰越高,产生的ROS的量也越多,当AOPP氧化修饰程度达1/140,能显著性增加ROS的量,1/280AOPP进一步刺激ROS的产生。AOPP (1/140)的浓度达到200μg/ml时,其诱导产生ROS的量最高。用抑制剂apocynin、DPI、 NAC和PDTC预孵育细胞0.5h、1h和2h,再用AOPP继续培养24h,结果表明四种抑制剂均能显著性抑制ROS的产生,且随着浓度及预孵育时间的延长呈现一定的依赖性,其中PDTC的抑制作用最为显著。3.2.5复方黄甘提取物及丹皮酚对AOPP诱导的THP-1巨噬细胞ROS产生的影响随着预孵育时间的延长,复方黄甘提取物对AOPP诱导THP-1巨噬细胞ROS产生的抑制作用也提高。当复方黄甘提取物预孵育时间为1h,浓度为400μg/ml时,其对AOPP诱导THP-1巨噬细胞ROS产生的抑制作用最大,抑制率为25.76%,弱于抑制剂PDTC的抑制作用,但高于其他三种抑制剂的抑制程度。三个时间点的丹皮酚均能显著性抑制AOPP诱导THP-1巨噬细胞ROS的产生量,且随着丹皮酚浓度的增加其对THP-1巨噬细胞ROS的产生量的抑制作用显著性升高。当丹皮酚预孵育时间为1h,浓度为400gM时,其对AOPP诱导THP-1巨噬细胞ROS产生的抑制作用最大,抑制率为19.57%,略高于抑制剂apocynin、DPI和NAC的抑制作用,但仍低于抑制剂PDTC的抑制程度。3.2.6复方黄甘提取物及丹皮酚对AOPP诱导的THP-1巨噬细胞细胞因子产生的影响AOPP能显著性上调THP-1巨噬细胞TNF-α、IL-1β和IL-6的基因表达及蛋白分泌。用四种抑制剂预处理0.5h后再给以AOPP刺激,结果显示它们均能显著性抑制AOPP诱导THP-1巨噬细胞TNF-α、IL-1β和IL-6的基因表达及蛋白分泌。当用复方黄甘提取物及丹皮酚预处理后,均能显著性下调AOPP诱导THP-1巨噬细胞TNF-α、IL-1β和IL-6的基因表达及蛋白分泌,但其下调程度弱于DPI和PDTC。3.2.7丹皮酚对AOPP诱导的THP-1巨噬细胞MCP-1、RAGE受体及清道夫受体CD36、SR-A、SR-B1的影响AOPP能显著性上调RAGE的表达,丹皮酚浓度在100-200μM范围内,能显著性抑制AOPP诱导的RAGE的表达上调。AOPP能显著性上调CD36的表达,丹皮酚浓度在100-400gM范围内,均能显著性抑制AOPP诱导的CD36的表达上调,且随着浓度的增加,其抑制作用逐渐减弱。AOPP能显著性下调SR-A的表达,丹皮酚浓度到达200μM时,能显著性上调AOPP诱导的SR-A的表达,且随着浓度的增加,其SR-A的表达量逐渐增加。AOPP能显著性下调SR-B1的表达,丹皮酚浓度在100-400μM范围内,均能显著性上调AOPP诱导的SR-B1的表达,且随着浓度的增加,其SR-B1的表达量逐渐增加。4.研究结论4.1复方黄甘提取物可能通过升高NO和降低ROS、TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1,减轻微炎症反应和氧化应激损伤,从而达到延缓肾衰进展的治疗作用。4.2丹皮酚可能通过调节THP-1巨噬细胞表面RAGE、CD36、SR-A和SR-B1受体表达,活化NADPH氧化酶途径释放ROS,进而活化NF-кB,最终导致TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1的分泌,从而达到减轻氧化应激损伤的效果。