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目的:本研究旨在探讨细胞周期相关转录因子E2F transcription factor 7(E2F7)通过调控自噬从而影响高糖诱导的肾小管上皮细胞(NRK-52E)EMT的作用和机制,以及白藜芦醇(resveratrol,Res)是否可以通过介导E2F7的表达上调自噬水平,从而抑制肾小管上皮细胞EMT的发生发展,为糖尿病肾病寻找新的有效的治疗靶点。方法:(1)将24只健康雄性C57-BL/6小鼠随机分为正常对照组(NC组)、糖尿病模型组(DM组)、白藜芦醇干预组(Res组),每组各8只。用链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)复制1型糖尿病小鼠模型。从糖尿病模型复制成功8周起,Res组连续灌胃给予Res干预12周后处死各组小鼠测定相应生化指标和肾脏指数。HE、Masson染色比较各组肾组织的病理形态学改变;免疫组织化学染色(Immunohistochemistry,IHC)观察各组肾组织E2F7的表达情况;蛋白免疫印迹(Western blot,WB)检测各组E2F7、自噬相关蛋白LC3 II/I、Beclin1以及EMT指标E-cadherin、α-SMA、Snail1及纤维化相关指标Collagen IV的蛋白表达水平,实时荧光定量(real-time PCR)检测Collagen IV、E-cadherin、α-SMA的m RNA表达水平。(2)正常糖(NG)和高糖(HG)培养NRK-52E细胞并于48h后收集细胞蛋白,Western blot分别检测E2F7、Beclin1、LC3 II/I、p62以及E-cadherin、α-SMA、Snail1和Collagen IV的表达。免疫荧光(Immuno-fluorescence)检测E-cadherin、α-SMA、E2F7的表达。(3)在NG和HG培养的NRK-52E细胞中分别加入浓度为25μmol/L的Res,培养48h后收集蛋白样本,WB检测E2F7、Beclin1、LC3 II/I、p62以及E-cadherin、α-SMA、Snail1和Collagen IV的蛋白表达。(4)在NG和HG培养的NRK-52E细胞中分别转染过表达E2F7质粒(overexpression E2F7 plasmid)和空载质粒(Vector,Vec),分为NG+Vec组,NG+E2F7组,HG+Vec组和HG+E2F7组,48h后收集细胞蛋白样本,Western blot检测E2F7、Beclin1、LC3 II/I、p62以及E-cadherin、α-SMA、Snail1和Collagen IV的蛋白表达水平。(5)在NG和HG培养的NRK-52E细胞中分别转染对照si RNA和E2F7 si RNA并加入浓度为25μmol/L的白藜芦醇,培养48h后收集样本,WB检测E2F7、LC3 II/I、p62以及E-cadherin、α-SMA和Collagen IV的蛋白表达水平。结果:(1)DM组小鼠模型复制成功。与NC组相比,DM组的空腹血糖(FBG)、肾脏指数(KI)、血肌酐(Cr)、24h尿微量白蛋白(UAER)和尿量总蛋白(UTP)均显著增高(P<0.05)。HE、Masson染色结果表明DM组小鼠肾组织出现了肾纤维化病变。IHC结果显示DM组小鼠肾小管及间质中E2F7阳性棕黄色颗粒表达较NC组减少,并且DM组小鼠肾组织的E2F7、E-cadherin、Beclin1、LC3 II/I蛋白水平较NC组均显著降低(P<0.05),α-SMA、Snail1、Collagen IV蛋白水平较NC组均显著升高(P<0.05)。经Res干预后,除了血糖无显著差异外,Res组中其余生化指标和肾脏指数均显著低于DM组(P<0.05);肾纤维化病变明显得到改善;肾组织中E2F7阳性表达增多;E2F7、E-cadherin、Beclin1、LC3 II/I蛋白水平较DM组显著升高(P<0.05),而α-SMA、Snail1、Collagen IV蛋白水平较DM组显著降低(P<0.05)。与DM组比较,Res组的E-cadherin m RNA表达增高(P<0.05),α-SMA和Collagen IV的m RNA表达降低(P<0.05)。(2)(1)与正常糖组(NG)比较,高糖组(HG)NRK-52E细胞中p62、α-SMA、Snail1和Collagen IV蛋白的表达均增加(P<0.05),E2F7、E-cadherin、Beclin1和LC3II/I蛋白表达均减少(P<0.05)。(2)与HG组比较,HG+Res组NRK-52E细胞中E2F7、E-cadherin、Beclin1、LC3 II/I蛋白表达均增加(P<0.05),α-SMA、Snail1、Collagen IV和p62的蛋白表达水平均减少(P<0.05),自噬水平有所恢复。(3)(1)与HG+Vec.组相比,HG+E2F7组NRK-52E细胞中p62、α-SMA、Snail1和Collagen IV蛋白的表达均显著减少(P<0.05),E2F7、E-cadherin、Beclin1和LC3 II/I蛋白表达均显著增加(P<0.05)。(2)与HG+Res组比较,HG+Res+si E2F7组NRK-52E细胞中α-SMA、Collagen IV和p62的蛋白表达水平均增加(P<0.05),E2F7、LC3 II/I和E-cadherin的蛋白表达水平均减少,自噬水平受到抑制。结论:(1)无论是在小鼠糖尿病肾病肾组织,还是在高糖培养的NRK-52E细胞中,E2F7的蛋白表达水平均受到抑制,自噬水平下调。(2)在高糖培养的NRK-52E细胞中,过表达E2F7可能通过促进自噬,而抑制胶原的合成及EMT的发生。(3)白藜芦醇可能通过上调E2F7的表达,恢复自噬水平,抑制EMT的发生,减轻肾小管间质纤维化,起到保护肾脏的作用。